施河麗，向必坤，彭五星，尹忠春，羅 芳，譚 軍

（湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000）

在煙草種植過程中大部分煙區(qū)都存在長期連作，化學肥料大量使用，化學農(nóng)藥和除草劑濫用，植煙土壤微生態(tài)失衡等問題，使得煙株生長發(fā)育受阻，煙葉品質(zhì)下降，煙草土傳病害加重等現(xiàn)象日益凸顯。施肥是影響土壤質(zhì)量和可持續(xù)發(fā)展的重要措施之一［1］。但由于肥料種類的不同，施肥對土壤質(zhì)量的影響也存在較大差異，如一些研究發(fā)現(xiàn)長期施用化學肥料會導致土壤質(zhì)量下降［2-3］；有機肥、無機有機肥配施能提升土壤質(zhì)量［4-5］。施用的肥料可以通過影響土壤化學成分引起土壤微生物活性、土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變，也可以通過改變土壤的物理性狀影響地上植被的生長狀況，從而間接地影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。近年來施肥對土壤酶活性、微生物量碳氮、微生物多樣性和微生物活性等的影響方面引起了研究人員的廣泛關(guān)注。Kamaa等［6］試驗發(fā)現(xiàn)有機肥或有機無機混施能明顯影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。于冰等［7］在湖南祁陽的長期定位試驗研究發(fā)現(xiàn)，施用有機肥不但可以緩解化肥引起的土壤酸化，還能支持更大、更豐富的微生物群體。袁紅朝等［8］研究了同地帶的水稻土不同施肥下的微生物群落變化，提出化肥配施有機物料可顯著增加土壤細菌種群多樣性和數(shù)量。Yu等［9］在淋溶土地上的施肥研究發(fā)現(xiàn)，無機肥的施用抑制微生物生長，有機肥的施用促進微生物生長。由此可知，有機肥、無機有機肥配施對土壤微生物表現(xiàn)為促進作用。

前人利用Illumina Miseq高通量測序平臺探討了施肥對土壤中微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)組成的影響［10-11］。然而，對比研究有機無機肥料配施培肥土壤的特征及優(yōu)勢，尤其是施用不同有機肥影響了哪些關(guān)鍵菌群，進而調(diào)控了土壤養(yǎng)分循環(huán)，值得進行深入探索。本文通過3年定位試驗，研究了施用不同有機肥對土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為優(yōu)化恩施煙區(qū)施肥制度，提高土壤肥力，維護煙田土壤微生態(tài)系統(tǒng)等方面提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

于2015～2017年連續(xù)在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣椒園鎮(zhèn)水井坳村（北緯29°96′，東經(jīng)109°37′，海拔1 080 m）設(shè)置田間試驗。試驗區(qū)屬中亞熱帶季風濕潤型山地氣候，年均氣溫13.7℃，無霜期263 d，年降水量1 635.3 mm，年日照時數(shù)1 212.4 h。土壤類型為恩施煙區(qū)具有代表性的山地黃棕壤，土壤質(zhì)地為壤土。試驗開始前耕層（0～20 cm）土壤的基本理化性質(zhì):土壤pH值 6.2（水土比 2.5∶1），有機質(zhì) 32.17 g·kg-1，堿解氮 146.57 mg·kg-1，有效磷 33.61 mg·kg-1，速效鉀275.00 mg·kg-1。供試作物為烤煙，品種為云煙87。

試驗處理分別為常規(guī)化肥（CF）、煙草秸稈生物有機肥（TBF）+化肥、高碳基土壤修復肥（HCF）+化肥。施氮量均為97.5kg·hm-2，試驗中氮磷鉀肥料配比為 N∶P2O5∶K2O=1∶2∶3，所有處理在等量NPK養(yǎng)分的基礎(chǔ)上進行，有機肥不足的NPK由化肥提供，化肥種類有煙草專用復合肥（8-12-24）、過磷酸鈣（0-12-0）、硝銨磷肥（30-6-0）、硫酸鉀（0-0-50）。煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥全部用作基肥條施，其它試驗操作按照《恩施州煙草公司烤煙生產(chǎn)技術(shù)指導方案》的常規(guī)方法進行。煙草秸稈生物有機肥（TBF），其有機質(zhì)（干基）≥45%、含氮（N）量為1%、含磷（P2O5）量為1.5%、含鉀（K2O）量為2.5%、有效活菌數(shù)（cfu）≥0.20億·g-1、pH值8.2；高碳基土壤修復肥（HCF），其有機質(zhì)（干基）≥45%、含氮（N）量為2%、含磷（P2O5）量為2%、含鉀（K2O）量為2%、生物炭≥20%、pH值7.4。試驗設(shè)2次重復，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積40 m2，每小區(qū)植煙60株。

表1 不同施肥處理肥料投入量 （kg·hm-2）

1.2 樣品采集

于2017年9月中旬，煙葉采收結(jié)束后，按S型五點采樣法分小區(qū)采集耕層（0～20 cm）土壤，混合均勻后用冷藏箱保存土樣，帶回實驗室。將土壤樣品去除烤煙根系殘體和雜物后分為兩份，一份凍存于-20℃冰箱中，用于土壤微生物分析；另一份自然風干后，用于測定土壤基本理化性質(zhì)。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定

各指標的測定參照《土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法》［12］。土壤pH值采用電位法測定（水土比2.5∶1）；土壤有機質(zhì)（SOM）采用重鉻酸鉀容量法測定；土壤堿解氮（AN）采用擴散法測定；土壤有效磷（AP）采用硫酸鉬銻抗比色法測定；土壤速效鉀（AK）采用火焰光度法測定。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取和PCR擴增

擴增細菌16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)，采用正向引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAG CA-3’），反向引物 806R（5’-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3’）。PCR反應體系為:土壤微生物DNA模板（10 ng·μL-1）2.5μL，F(xiàn)orward引物和Reverse引物（1.0 μ mol·L-1） 各 5.0μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL。PCR擴增條件為: 95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，25個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫進行文庫純化、質(zhì)檢后，送上海伯豪生物技術(shù)有限公司，采用MiSeq sequencer進行測序。

1.3.3 生物信息學分析流程

采用Mothur軟件將測序序列去重復，與已知數(shù)據(jù)庫GreenGene、Silva等比對，去除嵌合體序列和線粒體、葉綠體序列。將優(yōu)化序列進行物種注釋并聚類得到OTU（Operational Taxonomic Units），根據(jù)OTU的序列組成得到其物種分類?；贠TU聚類分析結(jié)果，對樣品的多樣性及組間差異進行分析，并結(jié)合物種分類信息，在各個分類水平上進行分類學分析。生物信息學高級分析由上海伯豪生物技術(shù)有限公司協(xié)助完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用R語言的VennDiagram包繪制Venn圖；利用Mothur軟件分別進行α多樣性指數(shù)計算和聚類分析；土壤理化性質(zhì)、細菌OTU數(shù)、α多樣性指數(shù)、物種組成及相對豐度等數(shù)據(jù)利用Excel 2007進行初處理和制圖，多重比較、方差分析和Spearman相關(guān)性分析用SPSS 22.0 軟件完成；細菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和典范對應分析（Canonical Correspondence Analysis，CCA）用R語言工具完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)

由表2可知，HCF處理的土壤堿解氮（AN）含量最低，且顯著低于CF和TBF處理。HCF處理的pH值、有機質(zhì)（SOM）、有效磷（AP）和速效鉀（AK）含量有高于CF和TBF處理的趨勢，但無顯著差異。與CF處理相比，HCF處理SOM、AP和AK含量分別增加了2.63%、8.39%和12.51%，而AN含量顯著降低了34.09%；TBF處理AP和AK含量分別增加了5.78%和11.87%，而SOM和AN含量分別降低了4.54%和0.57%。

表2 不同施肥處理土壤理化性質(zhì)

2.2 不同施肥處理土壤細菌OTU數(shù)和α多樣性

在97%相似水平下，得到不同施肥處理土壤樣品中細菌OTU數(shù)為5 884～6 458（表3），大小依次為TBF＜HCF＜CF，CF處理土壤細菌OTU數(shù)有高于TBF和HCF兩個處理的趨勢。Chao指數(shù)可以反映微生物群落物種豐富度，其值越大表明微生物群落豐富度越高；香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)可以反映微生物群落物種多樣性，其值越大表明微生物群落多樣性越高。由表3可知，HCF處理土壤細菌Chao指數(shù)、香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)均最高，TBF處理次之，CF處理最??；TBF和HCF處理土壤細菌Chao指數(shù)、香濃指數(shù)和辛普森指數(shù)有高于CF處理的趨勢。α多樣性分析結(jié)果表明，施用煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥有提高土壤細菌多樣性的趨勢。

表3 不同施肥處理土壤細菌多樣性指數(shù)

2.3 不同施肥處理土壤細菌OTUs分布

Venn圖能夠反映樣品之間共有和特有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)樣品之間的OTU組成相似程度。各處理土壤樣品一共有18 517個細菌OTU（圖1），共有的細菌OTUs數(shù)量為3 272個，只占OTU總數(shù)的16.67%，說明施用煙草秸稈生物有機肥和高碳土壤修復肥對細菌OTU豐度的影響明顯。CF和TBF樣品共有1 360個細菌OTUs，CF和HCF樣品共有835個細菌OTUs，TBF和HCF樣品共有3 448個細菌OTUs，TBF和HCF樣品共有的OUT數(shù)目最高，說明不同有機肥處理間的細菌類群組成相似性＞化肥處理與有機肥處理間的細菌類群組成相似性。CF、TBF和HCF樣品特有的OTUs數(shù)量為896～3 213，大小依次為TBF＜HCF＜CF，CF樣品中特有的OTUs數(shù)量最多，而施用煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥分別使土壤特有細菌種類下降了72.11%和70.12%。

圖1 不同施肥處理土壤細菌Venn圖

2.4 不同施肥處理土壤細菌群落組成

2.4.1 門水平上的細菌群落組成

在門水平上，CF、TBF和HCF處理分別獲得33、30和31個類群。將相對豐度＜1%的類群歸類為其他，得到12個類群。由圖2可知，有4個主要的細菌種群占所有序列的多數(shù)（80.59%～83.31%），其中，綠彎菌門（Chloroflexi）占17.53%～27.17%，放線菌門（Actinobacteria）占24.37%～32.92%，變形菌門（Proteobacteria）占21.55%～26.90%，酸桿菌門（Acidobacteria）占7.50%～9.27%；CF處理中綠彎菌門（Chloroflexi）相對豐度最高，TBF和HCF處理中放線菌門（Actinobacteria）相對豐度最高。進一步分析處理間差異發(fā)現(xiàn)，TBF和HCF處理綠彎菌門（Chloroflexi）、Saccharibacteria、厚壁菌門（Firmicutes）、WD272和藍細菌門（Cyanobacteria）的相對豐度分別比CF處理降低了31.41%和35.47%、69.26%和53.66%、4.28%和40.84%、88.70%和97.61%、62.94%和75.35%；而TBF和HCF處理放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度分別比CF處理提高了35.08%和25.41%、4.33%和24.87%、23.50%和1.58%、34.40%和64.74%、40.55%和73.16%、115.49%和62.80%。

圖2 不同施肥處理細菌門水平組成（相對豐度＞1%）

2.4.2 屬水平上的細菌群落組成

從屬的分類水平來看（表4），不同施肥處理間具有顯著差異的細菌屬有16個。與CF處理相比，TBF處理顯著增加了節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、貪噬菌屬（Variovorax）的相對豐度；HCF處理顯著增加了Chthonomonas、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）的相對豐度，顯著降低了狹義梭菌屬8（Clostridium sensu stricto8）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）的相對豐度；TBF和HCF處理顯著增加了Patulibacter、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、農(nóng)研絲桿菌屬（Niastella）、Rice ClusterI的相對豐度，顯著降低了Nicotiana otophora、Perlucidibaca、Fonticella、中華單胞菌屬（Sinomonas）的相對豐度。枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）是HCF處理中特有的細菌屬。

表4 不同施肥處理間相對豐度顯著差異的細菌屬 （%）

2.5 細菌群落組成的PCA聚類分析及豐度UPGMA聚類分析

主成分分析（PCA）表明（圖3），第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的貢獻率分別為36.37%和19.71%，累計貢獻率達到56.08%，說明PC1和PC2是變異的主要來源，可以解釋變量的絕大部分信息。6個樣品點在PC軸上分布有差異，CF樣品點在PCA圖中的距離較近，聚在一起，并且與TBF和HCF處理樣品點相距較遠。UPGMA聚類分析表明（圖4），施用有機肥處理（TBF1、TBF2、HCF1和HCF2）的各菌群豐度與施用化肥處理（CF1和CF2）的各菌群豐度被聚類為2個分支，說明施用有機肥后各菌群豐度發(fā)生了明顯變化；CF1和CF2、HCF1和HCF2樣品間相似性較高。

圖3 細菌群落的主成分分析

圖4 門水平上的細菌相對豐度聚類樹

2.6 不同施肥處理土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

由表5可知，相對豐度差異顯著細菌屬與土壤部分理化指標表現(xiàn)出顯著的相關(guān)關(guān)系，其中賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、Oceanobacillus、Fonticella均與土壤堿解氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而Anoxybacillus、Virgibacillus與土壤堿解氮含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系；Patulibacter、Rice ClusterI與土壤速效鉀含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而狹義梭菌屬8（Clostridium sensu stricto8）、中華單細胞菌屬（Sinomonas）與土壤速效鉀含量呈顯著負相關(guān)關(guān)系。

表5 相對豐度差異顯著細菌屬與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系

為進一步分析不同土壤理化性質(zhì)對細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)進行典范對應分析（CCA）（圖5）。結(jié)果顯示，前兩個排序軸總共解釋了86.81%的細菌群落變化，第一排序軸（CCA1）解釋了74.49%，第二排序軸（CCA2）解釋了12.32%，其中第一排序軸（CCA1）對土壤細菌群落變化解釋最多。CF、TBF和HCF處理樣品點彼此分離，TBF和HCF處理樣品點都分布在縱坐標軸的左側(cè)。AN和AK與橫坐標正軸夾角較小，pH值、SOM和AP與橫坐標負軸夾角較小，表明這5個指標與CCA1相關(guān)性較高。從圖中箭頭的分布可以看出，pH值、AN和AK這3個指標與土壤細菌的群落結(jié)構(gòu)存在較強的相關(guān)性。

圖5 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)的CCA分析

3 討論

3.1 不同施肥處理對土壤理化性質(zhì)的影響

有機肥的種類和性質(zhì)是決定其培肥作用的主要因素。土壤堿解氮是植物能直接吸收利用的生物有效態(tài)氮，能反映土壤近期內(nèi)氮素供應狀況，是銨態(tài)氮（NH4+-N）、硝態(tài)氮（NO3--N）、氨基酸、酰胺和易水解的蛋白質(zhì)氮的總和［13］。本研究表明，高碳基土壤修復肥處理耕層土壤中堿解氮含量顯著下降。這與前人的研究結(jié)果不同［14-15］，其中的可能原因主要有:其一，高碳基土壤修復肥與化肥配施條件下，土壤中有機碳含量增加使得土壤碳氮比提高［16］，反而降低了土壤中微生物對有機氮的礦化速率［17］；其二，高碳基土壤修復肥的多孔結(jié)構(gòu)和含氧官能團會吸附和固定土壤和肥料中的NH4+-N，暫時降低土壤氮素的有效性［18］?？傮w來看，煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥對土壤速效養(yǎng)分的影響存在差異，施用高碳基土壤修復肥抑制了土壤中氮的有效性。

3.2 不同施肥處理對土壤細菌群落多樣性的影響

多樣性指數(shù)是評價土壤細菌群落多樣性的重要指標，多樣性指數(shù)越高表明土壤細菌群落的豐富度和多樣性越高。通過多樣性指數(shù)評價，本研究中煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥兩個處理細菌群落的Chao、香濃和辛普森指數(shù)有高于化肥處理的趨勢，說明施用煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥，在一定程度上有利于提高土壤細菌群落多樣性，引起了土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，化肥處理煙田土壤細菌OTU總數(shù)和獨有的細菌OTU數(shù)均為最多，說明單施化肥可能會引起某些土壤微生物的富集和一些微生物種類的喪失，這與姚健等［19］、趙蘭鳳等［20］的研究結(jié)果相一致，因此應避免長期施用化肥；煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥兩個處理共有的OTU數(shù)最高，說明它們的細菌類群組成較為相似。

3.3 不同施肥處理對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)組成的影響

煙田耕層土壤中，綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）等是主要細菌類群，這與前人的研究相印證［21-22］。節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）是所有土壤細菌中最為常見的細菌之一，其在環(huán)境的適應生長中，擁有很多不同的功能，如降解煙堿［23-24］、生物除磷［25］、去除重金屬［26］等。據(jù)報道貪噬菌屬可以降解很多化合物，包括腈類除草劑［27］、原油相關(guān)的硫代物［28］、煙堿類殺蟲劑噻蟲啉［29］等。本研究發(fā)現(xiàn)節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和貪噬菌屬（Variovorax）在煙草秸稈生物有機肥處理土壤樣品中的豐度顯著高出化肥處理，推測施用煙草秸稈生物有機肥可能刺激了與煙堿降解相關(guān)細菌的生長，其原因有待進一步深入研究。

研究還發(fā)現(xiàn)，在屬水平上一些對植物生長有益的促生菌和拮抗菌在煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥處理土壤樣品中的豐度顯著增加。例如，Patulibacter具有溶磷作用［30］，而溶磷細菌是根際促生菌（PGDR）中重要的一類，可將土壤中難以被植物吸收利用的磷，特別是礦物磷轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢员恢参镂盏挠行Я?；短芽孢桿菌屬（Brevi－bacillus）具有根際拮抗作用，徐瑩瑩等［31］研究表明短芽孢桿菌屬在煙草根際拮抗菌中所占的比例為9.1%；枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus）對煙草黑脛病菌、煙草赤星病菌、番茄葉霉病菌、番茄灰霉病菌、水稻串珠鐮刀病菌和水稻紋枯病菌等多種植物病原菌有明顯抑制作用［32］。說明施用煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥，可能有利于根際促生菌和拮抗菌的生長，從而促進植物根系的生長，抵抗植物病原菌，提高植物應對環(huán)境壓力。

3.4 不同施肥處理土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

土壤理化性質(zhì)如pH值、有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分的改變是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的重要因素［33-34］。由表4可知AN和AK與部分差異顯著細菌屬顯著相關(guān)。CCA分析結(jié)果進一步證明了施用煙草秸稈生物有機肥和高碳基土壤修復肥對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了深刻的影響，其中土壤pH值、AN和AK含量是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的重要因子，這與許多研究結(jié)果類似［35-37］。pH值對微生物適宜生存環(huán)境影響巨大；氮是土壤中最為活躍的大量營養(yǎng)元素之一，也是植物需要量較大的營養(yǎng)元素；鉀是土壤中常因供應不足而限制作物生長和造成減產(chǎn)及品質(zhì)下降的主要營養(yǎng)元素之一，土壤鉀素的供給主要是有機肥。

4 結(jié)論

有機無機肥料配施對植煙土壤的理化性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響，高碳基土壤修復肥配施化肥可顯著降低土壤堿解氮含量。有機無機肥料配施有降低土壤細菌OTUs數(shù)量的趨勢，同時有利于提高土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性。有機無機肥料配施顯著增加了土壤Patulibacter、短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、農(nóng)研絲桿菌屬（Niastella）等有益細菌屬豐度。有機無機肥料配施培肥改土后，土壤理化指標對細菌群落產(chǎn)生顯著影響的因子為pH值、AN和AK。綜上，有機無機肥料配施改變了植煙土壤養(yǎng)分狀況，調(diào)節(jié)了植煙土壤細菌群落結(jié)構(gòu)。