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        膠凍樣類芽孢桿菌菌粉的研制及功能菌株的存活性研究*

        2019-08-30 09:20:32張愛民李乃康曹丹丹張璐琳
        肥料與健康 2019年3期
        關(guān)鍵詞:膠凍菌粉發(fā)酵液

        張愛民,李乃康,曹丹丹,張璐琳

        (1.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心 河北保定 071051; 2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定 071051; 3.蘇州工業(yè)園區(qū)報關(guān)有限公司 江蘇蘇州 215000)

        膠凍樣類芽孢桿菌是一種能夠分解硅酸鹽礦物的細菌,因此一些學(xué)者將其稱為硅酸鹽細菌。由于該菌株具有分解鉀長石、云母等鋁硅鹽類原生質(zhì)態(tài)礦物的能力,使土壤中的不溶性K、P、Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄栽毓┲参锢?,同時還可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)以促進植物生長,因而其在農(nóng)業(yè)上獲得了廣泛應(yīng)用。除此之外,該菌株還廣泛應(yīng)用于采礦、冶金、制藥等領(lǐng)域[1]。

        以膠凍樣類芽孢桿菌為出發(fā)菌株,可以研制出應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的微生物菌劑,但由于該菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)低,致使在實際應(yīng)用中的接種數(shù)量與其他農(nóng)用微生物菌株相差較大,限制了該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用[2]。河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心的技術(shù)人員創(chuàng)造性地采用現(xiàn)代生物分離技術(shù),利用膠凍樣類芽孢桿菌內(nèi)生芽孢具有耐高溫、高壓、干燥、氧化等不良因素的特性,采用噴霧干燥工藝研制出高含量膠凍樣類芽孢桿菌菌粉制劑[3]。

        隨著我國現(xiàn)代高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展,要求肥料的研制向有機-無機-生物方向發(fā)展,其中關(guān)鍵因素是耐高滲透壓微生物菌株的篩選,以便更好地與化學(xué)肥料協(xié)同作用。筆者研究了將膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與化肥及草炭配伍研制出復(fù)合微生物肥料及功能膠凍樣類芽孢桿菌菌株的存活情況,為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉肥料制劑在化肥工業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        (1)菌種:膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)HB- 02,河北大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)保實驗室保存。

        (2)其他原料:草炭(165 μm/100目),河北滿城國興草炭加工廠;化學(xué)肥料,購自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場。

        (3)檢測培養(yǎng)基:蔗糖5.000 g,Na2HPO4·12H2O 2.000 g,MgSO4·7H2O 0.500 g,F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g,CaCO30.100 g,瓊脂18.000~20.000 g,蒸餾水1 000.0 mL,pH 7.5~8.0。

        1.2 主要儀器和設(shè)備

        LPR300噴霧干燥機,無錫聞華干燥設(shè)備有限公司;DHC- 500型碟片式離心機,遼陽市制藥機械廠;BN0203型電子天平,上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司;DH- 500型恒溫培養(yǎng)箱,北京中興偉業(yè)儀器有限公司;HZQ- F160型恒溫振蕩器,哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;LDZF- 50KB型全自動滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;UB100i型顯微鏡,重慶UOP光電技術(shù)有限公司。

        1.3 方法

        (1)菌落和菌體形態(tài)特征

        取培養(yǎng)12 h膠凍樣類芽孢桿菌的斜面,無菌操作涂片,經(jīng)革蘭氏染色后觀察其菌體形態(tài);同時在斜面中加入一定量的無菌水,涂布于檢測培養(yǎng)基上,于32 ℃倒置培養(yǎng)36 h,觀察其菌落形態(tài)。

        (2)有效活菌數(shù)的測定及芽孢收率的計算

        從發(fā)酵終點的膠凍樣類芽孢桿菌發(fā)酵液中吸取5.0 mL于45.0 mL無菌水中,按1∶10進行梯度稀釋,得到10-1,10-2,10-3,10-4……稀釋度的菌懸液;每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度,用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL,均勻地涂布于檢測培養(yǎng)基平板上;每一稀釋度重復(fù)3次,同時以無菌水作空白對照,于32 ℃培養(yǎng)48 h,以出現(xiàn)20~300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),統(tǒng)計有效活菌數(shù)。

        芽孢收率為噴霧干燥后得到產(chǎn)品的生物量與噴霧干燥前生物量的比值,按式(1)計算:

        (1)

        (3)發(fā)酵液的濃縮處理技術(shù)

        膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株在20 m3發(fā)酵罐發(fā)酵到終點的發(fā)酵液采用碟片式離心機進行濃縮處理,為下一步發(fā)酵液的噴霧干燥處理提供準(zhǔn)備。

        (4)進風(fēng)溫度對芽孢生物量及收率的影響

        設(shè)定噴霧干燥塔的進風(fēng)溫度分別為110、130、150和170 ℃,干燥后進行芽孢收率的測定,進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥的理想進風(fēng)溫度。

        (5)通風(fēng)量對芽孢生物量及收率的影響

        設(shè)定噴霧干燥塔的通風(fēng)量分別為10、15、20以及25 m3/min,干燥后進行芽孢收率的測定,進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥最適宜的通風(fēng)量。

        (6)進料速率對芽孢生物量及收率的影響

        設(shè)定噴霧干燥塔的進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h,干燥后進行芽孢收率的測定,進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥較為理想的進料速率。

        (7)3批次發(fā)酵液噴霧干燥結(jié)果

        采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗,裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后,首先進行離心濃縮,然后加入填充劑,再進行噴霧干燥,最后測定其芽孢收率及有效活菌數(shù)。

        (8)HB- 02菌株在不同復(fù)合微生物肥料中的存活率

        從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場購買的氮肥、磷肥及鉀肥按一定質(zhì)量比與草炭及保護劑混合后,得到不同N、P2O5、K2O含量及有機質(zhì)含量的有機-無機混合物,然后加入40.0 g通過上述噴霧干燥工藝研制的高含量膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉(50.0×108cfu/g),制成不同N- P2O5- K2O含量的復(fù)合微生物肥料。試驗共設(shè)T1、T2、T3、T4和T55個處理,每個處理樣品質(zhì)量為500.0 g,3次重復(fù),分別裝入無菌聚丙烯袋中密封常溫保存,在不同時間取樣測定膠凍樣類芽孢桿菌的有效活菌數(shù)。T1、T2、T3、T4和T5的N、P2O5和K2O含量如下:T1,w(N+P2O5+K2O)=0%;T2,w(N+P2O5+K2O)=8%;T3,w(N+P2O5+K2O)=15%;T4,w(N+P2O5+K2O)=25%;T5,w(N+P2O5+K2O)=30%。

        2 結(jié)果和討論

        2.1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落和菌體形態(tài)特征

        如圖1所示,在檢測培養(yǎng)基上,膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落表面光滑,邊緣整齊,無色透明,濕潤有光澤,隆起,質(zhì)地黏稠,有彈性,挑起時可拉成絲。

        圖1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落形態(tài)

        圖2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌體形態(tài)

        如圖2所示:培養(yǎng)12 h的膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株經(jīng)革蘭氏染色以后,菌體呈粗長桿狀,末端圓形,大小為(1.0~1.8) μm×(3.0~7.0) μm,革蘭氏染色陰性,菌體中常有1~2個大脂肪顆粒;培養(yǎng)后期在菌體中形成芽孢,芽孢處于中央或亞中央,橢圓形,大小為(1.5~2.0) μm×(2.0~3.5) μm,胞囊膨大后不成梭形;在營養(yǎng)貧乏時,菌體外包有2~4層橢圓形肥大莢膜,大小為(15.0~20.0) μm×(20.0~35.0) μm,而在營養(yǎng)豐富時形成的莢膜較小或不形成莢膜。

        2.2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液的濃縮處理

        發(fā)酵液濃縮處理的目的在于縮短噴霧干燥后的處理時間,減輕后處理壓力,以便得到高含菌量的菌粉產(chǎn)品。當(dāng)膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株到達發(fā)酵終點后,首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐,然后選用DHC- 500型碟片式離心機進行離心濃縮,在得到的濃縮液中加入一定量的環(huán)糊精(目的是減輕濃縮液在噴霧干燥過程中的黏壁現(xiàn)象)后,進入噴霧干燥塔進行氣流干燥處理。

        2.3 進風(fēng)溫度對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

        首先設(shè)定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進料速率為0.5 t/h,通風(fēng)量為15 m3/min。在該條件下,將進風(fēng)溫度分別設(shè)定為110、130、150和170 ℃,通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。通過3批次試驗表明:進風(fēng)溫度為110~130 ℃時,黏壁現(xiàn)象嚴(yán)重,不易收集成品;進風(fēng)溫度為170 ℃時,黏壁現(xiàn)象輕微,成品呈粉末狀;進風(fēng)溫度為150 ℃時,能收集到粉末狀的成品,存在輕微的黏壁現(xiàn)象,樣品含水量低,菌粉的收集率在85%以上。因此,確定噴霧干燥處理的理想進風(fēng)溫度為150 ℃。

        2.4 通風(fēng)量對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

        噴霧干燥處理時,膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液在進料速率為0.5 t/h、進風(fēng)溫度為150 ℃的條件下,通風(fēng)量分別設(shè)定為10、15、20和25 m3/min,通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。試驗表明:在通風(fēng)量較低(10~15 m3/min)的情況下,黏壁現(xiàn)象嚴(yán)重;在通風(fēng)量較高(25 m3/min)的情況下,不利于菌粉的收集;在通風(fēng)量為20 m3/min條件下,集粉率較高,也不黏壁,菌粉收集率在85%以上。因此,確定噴霧干燥處理的理想通風(fēng)量為20 m3/min。

        2.5 進料速率對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

        首先設(shè)定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進風(fēng)溫度為150 ℃,通風(fēng)量為15 m3/min。在該條件下,進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h,通過LPR- 300型噴霧干燥機進行進料干燥處理。試驗表明:進料速率為0.50 t/h時,會使霧滴變小,噴出的霧滴過細、過輕,由于負壓渦旋作用而導(dǎo)致霧滴黏在噴頭上;進料速率為1.00 t/h時,單位時間內(nèi)單位料液水分的蒸發(fā)量降低,霧滴變大,導(dǎo)致無法完全干燥霧滴,樣品的含水量較高,容易堵塞噴頭,掛壁現(xiàn)象嚴(yán)重,影響了產(chǎn)品的集粉率。因此,選擇進料速率為0.75 t/h。

        2.6 3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥處理結(jié)果

        采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗,裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后,首先進行離心濃縮,然后加入填充劑,再進行噴霧干燥。噴霧干燥的工藝參數(shù)為進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃,此條件下3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果如表1所示。

        表1 3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果

        項目批次1批次2批次3平均發(fā)酵液體積/L13 65012 87013 56013 360有效菌含量/(×108,cfu/mL)12.012.511.612.0離心漿液體積/L1 2301 2251 3001 251含菌量/(×108,cfu/mL)118.3117.5108.2114.5收率/%88.889.589.489.2噴霧干燥菌粉質(zhì)量/t503.0471.4504.9493.1有效菌含量/(×108,cfu/g)265.4273.7256.4265.1平均收率/%81.580.282.381.3

        從表1可知,在進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量為20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃條件下,3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥的平均收率為81.3%,平均有效活菌數(shù)達到265.1×108cfu/g。

        在上述高濃度膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉中添加一定比例的輔料可以研制出含菌量為50.0×108cfu/g或100.0×108cfu/g的農(nóng)用微生物肥料制劑菌粉,該制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以直接作為肥料使用,也可作為生產(chǎn)微生物菌劑、復(fù)合微生物肥料或生物有機肥的菌粉原料。

        2.7 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復(fù)合微生物肥料中的存活性

        通過上述方法制備的膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與不同復(fù)合肥復(fù)配研制出復(fù)合微生物肥料并在室溫下保存,然后分別在第0、22、56、78和120 d時取樣,采用平板法測定膠凍樣類芽孢桿菌有效菌含量,該菌株在不同復(fù)合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化如圖3所示。

        圖3中處理T1、T2、T3、T4、T5的w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%,5個處理的復(fù)合微生物肥料在室溫下保存,隨保存時間的延長,膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈下降趨勢,但在120 d內(nèi)下降量較小,其中T5的有效活菌數(shù)從起始的4.53×108cfu/g降至120 d的3.17×108cfu/g,存活率為89.8%;但從120 d 保存至170 d,除T1外,其他各處理的復(fù)合微生物肥料膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)直線下降。根據(jù)該試驗結(jié)果,可確定所研制出的復(fù)合微生物肥料的保質(zhì)期應(yīng)不超過120 d。

        圖3 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復(fù)合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化

        農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》(NY/T 798—2015)中規(guī)定粉劑復(fù)合微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)保質(zhì)期為不低于3個月,w(N+P2O5+K2O)不超過25%。該試驗結(jié)果不僅提高了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中復(fù)合微生物肥料中w(N+P2O5+K2O)不超過25%的規(guī)定,保障了農(nóng)作物營養(yǎng)需求,而且延長了保存期,為復(fù)合微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應(yīng)用提供了有力保證[4]。

        通過方差分析進一步研究復(fù)合微生物肥料中N、P2O5、K2O含量和保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響,結(jié)果如表2所示。

        表2 方差分析結(jié)果

        源平方和自由度均方F值P(顯著性)時間1 808.0895361.61811.9440.000濃度171.044442.7611.4120.237誤差2 422.0228030.275總計119 892.00090

        從表2可知:由于P時間=0.000<0.050??芍獜?fù)合微生物肥料保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響達到顯著差異水平;而P濃度=0.237>0.05,說明復(fù)合微生物肥料的N、P2O5和K2O含量對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響未達到顯著性差異。

        3 結(jié)語

        膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵達到終點后,首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐,然后進行離心處理,通過離心濃縮和噴霧干燥研制出高含量菌粉,該菌株最佳噴霧干燥條件為進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃。通過對3批次膠凍樣類芽孢桿菌生物量的測定,在該工藝條件下芽孢平均收率在81.3%,平均有效菌數(shù)為265.1×108cfu/g。

        w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%的含膠凍樣類芽孢桿菌復(fù)合微生物肥料于室溫下保存,隨保存時間的延長,其有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢,但在120 d內(nèi)有效活菌數(shù)下降量較小,存活率基本在90.0%左右;但當(dāng)保存時間從120 d延長至170 d,除不含化肥的處理外,其余各處理的有效活菌數(shù)均呈直線下降。依據(jù)試驗結(jié)果,確定所研制出的復(fù)合微生物肥料的保質(zhì)期為不超過120 d。

        通過試驗研究,為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉的工業(yè)化原料生產(chǎn)及復(fù)合微生物肥料的研制及保存提供了理論依據(jù),但其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用效果試驗有待研究。

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