張愛民，李乃康，曹丹丹，張璐琳

(1.河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心 河北保定 071051； 2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河北保定 071051； 3.蘇州工業(yè)園區(qū)報關(guān)有限公司 江蘇蘇州 215000)

膠凍樣類芽孢桿菌是一種能夠分解硅酸鹽礦物的細菌，因此一些學(xué)者將其稱為硅酸鹽細菌。由于該菌株具有分解鉀長石、云母等鋁硅鹽類原生質(zhì)態(tài)礦物的能力，使土壤中的不溶性K、P、Si等轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄栽毓┲参锢?，同時還可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)以促進植物生長，因而其在農(nóng)業(yè)上獲得了廣泛應(yīng)用。除此之外，該菌株還廣泛應(yīng)用于采礦、冶金、制藥等領(lǐng)域[1]。

以膠凍樣類芽孢桿菌為出發(fā)菌株，可以研制出應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的微生物菌劑，但由于該菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)低，致使在實際應(yīng)用中的接種數(shù)量與其他農(nóng)用微生物菌株相差較大，限制了該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用[2]。河北大學(xué)生物技術(shù)研究中心的技術(shù)人員創(chuàng)造性地采用現(xiàn)代生物分離技術(shù)，利用膠凍樣類芽孢桿菌內(nèi)生芽孢具有耐高溫、高壓、干燥、氧化等不良因素的特性，采用噴霧干燥工藝研制出高含量膠凍樣類芽孢桿菌菌粉制劑[3]。

隨著我國現(xiàn)代高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效農(nóng)業(yè)的發(fā)展，要求肥料的研制向有機-無機-生物方向發(fā)展，其中關(guān)鍵因素是耐高滲透壓微生物菌株的篩選，以便更好地與化學(xué)肥料協(xié)同作用。筆者研究了將膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與化肥及草炭配伍研制出復(fù)合微生物肥料及功能膠凍樣類芽孢桿菌菌株的存活情況，為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉肥料制劑在化肥工業(yè)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

(1)菌種：膠凍樣類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)HB- 02，河北大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)與環(huán)保實驗室保存。

(2)其他原料：草炭(165 μm/100目)，河北滿城國興草炭加工廠；化學(xué)肥料，購自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場。

(3)檢測培養(yǎng)基：蔗糖5.000 g，Na2HPO4·12H2O 2.000 g，MgSO4·7H2O 0.500 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.005 g，CaCO30.100 g，瓊脂18.000～20.000 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 7.5～8.0。

1.2 主要儀器和設(shè)備

LPR300噴霧干燥機，無錫聞華干燥設(shè)備有限公司；DHC- 500型碟片式離心機，遼陽市制藥機械廠；BN0203型電子天平，上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司；DH- 500型恒溫培養(yǎng)箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HZQ- F160型恒溫振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；LDZF- 50KB型全自動滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；UB100i型顯微鏡，重慶UOP光電技術(shù)有限公司。

1.3 方法

(1)菌落和菌體形態(tài)特征

取培養(yǎng)12 h膠凍樣類芽孢桿菌的斜面，無菌操作涂片，經(jīng)革蘭氏染色后觀察其菌體形態(tài)；同時在斜面中加入一定量的無菌水，涂布于檢測培養(yǎng)基上，于32 ℃倒置培養(yǎng)36 h，觀察其菌落形態(tài)。

(2)有效活菌數(shù)的測定及芽孢收率的計算

從發(fā)酵終點的膠凍樣類芽孢桿菌發(fā)酵液中吸取5.0 mL于45.0 mL無菌水中，按1∶10進行梯度稀釋，得到10-1，10-2，10-3，10-4……稀釋度的菌懸液；每個樣品取3個連續(xù)適宜的稀釋度，用0.5 mL無菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，均勻地涂布于檢測培養(yǎng)基平板上；每一稀釋度重復(fù)3次，同時以無菌水作空白對照，于32 ℃培養(yǎng)48 h，以出現(xiàn)20～300個菌落數(shù)的稀釋度的平板為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計有效活菌數(shù)。

芽孢收率為噴霧干燥后得到產(chǎn)品的生物量與噴霧干燥前生物量的比值，按式(1)計算：

(1)

(3)發(fā)酵液的濃縮處理技術(shù)

膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株在20 m3發(fā)酵罐發(fā)酵到終點的發(fā)酵液采用碟片式離心機進行濃縮處理，為下一步發(fā)酵液的噴霧干燥處理提供準(zhǔn)備。

(4)進風(fēng)溫度對芽孢生物量及收率的影響

設(shè)定噴霧干燥塔的進風(fēng)溫度分別為110、130、150和170 ℃，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥的理想進風(fēng)溫度。

(5)通風(fēng)量對芽孢生物量及收率的影響

設(shè)定噴霧干燥塔的通風(fēng)量分別為10、15、20以及25 m3/min，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥最適宜的通風(fēng)量。

(6)進料速率對芽孢生物量及收率的影響

設(shè)定噴霧干燥塔的進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h，干燥后進行芽孢收率的測定，進而確定膠凍樣類芽孢桿菌噴霧干燥較為理想的進料速率。

(7)3批次發(fā)酵液噴霧干燥結(jié)果

采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗，裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后，首先進行離心濃縮，然后加入填充劑，再進行噴霧干燥，最后測定其芽孢收率及有效活菌數(shù)。

(8)HB- 02菌株在不同復(fù)合微生物肥料中的存活率

從河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科技市場購買的氮肥、磷肥及鉀肥按一定質(zhì)量比與草炭及保護劑混合后，得到不同N、P2O5、K2O含量及有機質(zhì)含量的有機-無機混合物，然后加入40.0 g通過上述噴霧干燥工藝研制的高含量膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉(50.0×108cfu/g)，制成不同N- P2O5- K2O含量的復(fù)合微生物肥料。試驗共設(shè)T1、T2、T3、T4和T55個處理，每個處理樣品質(zhì)量為500.0 g，3次重復(fù)，分別裝入無菌聚丙烯袋中密封常溫保存，在不同時間取樣測定膠凍樣類芽孢桿菌的有效活菌數(shù)。T1、T2、T3、T4和T5的N、P2O5和K2O含量如下：T1，w(N+P2O5+K2O)=0%；T2，w(N+P2O5+K2O)=8%；T3，w(N+P2O5+K2O)=15%；T4，w(N+P2O5+K2O)=25%；T5，w(N+P2O5+K2O)=30%。

2 結(jié)果和討論

2.1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落和菌體形態(tài)特征

如圖1所示，在檢測培養(yǎng)基上，膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落表面光滑，邊緣整齊，無色透明，濕潤有光澤，隆起，質(zhì)地黏稠，有彈性，挑起時可拉成絲。

圖1 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌落形態(tài)

圖2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株的菌體形態(tài)

如圖2所示：培養(yǎng)12 h的膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株經(jīng)革蘭氏染色以后，菌體呈粗長桿狀，末端圓形，大小為(1.0～1.8) μm×(3.0～7.0) μm，革蘭氏染色陰性，菌體中常有1～2個大脂肪顆粒；培養(yǎng)后期在菌體中形成芽孢，芽孢處于中央或亞中央，橢圓形，大小為(1.5～2.0) μm×(2.0～3.5) μm，胞囊膨大后不成梭形；在營養(yǎng)貧乏時，菌體外包有2～4層橢圓形肥大莢膜，大小為(15.0～20.0) μm×(20.0～35.0) μm，而在營養(yǎng)豐富時形成的莢膜較小或不形成莢膜。

2.2 膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液的濃縮處理

發(fā)酵液濃縮處理的目的在于縮短噴霧干燥后的處理時間，減輕后處理壓力，以便得到高含菌量的菌粉產(chǎn)品。當(dāng)膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株到達發(fā)酵終點后，首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐，然后選用DHC- 500型碟片式離心機進行離心濃縮，在得到的濃縮液中加入一定量的環(huán)糊精(目的是減輕濃縮液在噴霧干燥過程中的黏壁現(xiàn)象)后，進入噴霧干燥塔進行氣流干燥處理。

2.3 進風(fēng)溫度對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

首先設(shè)定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進料速率為0.5 t/h，通風(fēng)量為15 m3/min。在該條件下，將進風(fēng)溫度分別設(shè)定為110、130、150和170 ℃，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。通過3批次試驗表明：進風(fēng)溫度為110～130 ℃時，黏壁現(xiàn)象嚴(yán)重，不易收集成品；進風(fēng)溫度為170 ℃時，黏壁現(xiàn)象輕微，成品呈粉末狀；進風(fēng)溫度為150 ℃時，能收集到粉末狀的成品，存在輕微的黏壁現(xiàn)象，樣品含水量低，菌粉的收集率在85%以上。因此，確定噴霧干燥處理的理想進風(fēng)溫度為150 ℃。

2.4 通風(fēng)量對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

噴霧干燥處理時，膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液在進料速率為0.5 t/h、進風(fēng)溫度為150 ℃的條件下，通風(fēng)量分別設(shè)定為10、15、20和25 m3/min，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行干燥處理。試驗表明：在通風(fēng)量較低(10～15 m3/min)的情況下，黏壁現(xiàn)象嚴(yán)重；在通風(fēng)量較高(25 m3/min)的情況下，不利于菌粉的收集；在通風(fēng)量為20 m3/min條件下，集粉率較高，也不黏壁，菌粉收集率在85%以上。因此，確定噴霧干燥處理的理想通風(fēng)量為20 m3/min。

2.5 進料速率對膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株噴霧干燥芽孢收率的影響

首先設(shè)定膠凍樣類芽孢桿菌濃縮液噴霧干燥的進風(fēng)溫度為150 ℃，通風(fēng)量為15 m3/min。在該條件下，進料速率分別為0.50、0.75和1.00 t/h，通過LPR- 300型噴霧干燥機進行進料干燥處理。試驗表明：進料速率為0.50 t/h時，會使霧滴變小，噴出的霧滴過細、過輕，由于負壓渦旋作用而導(dǎo)致霧滴黏在噴頭上；進料速率為1.00 t/h時，單位時間內(nèi)單位料液水分的蒸發(fā)量降低，霧滴變大，導(dǎo)致無法完全干燥霧滴，樣品的含水量較高，容易堵塞噴頭，掛壁現(xiàn)象嚴(yán)重，影響了產(chǎn)品的集粉率。因此，選擇進料速率為0.75 t/h。

2.6 3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥處理結(jié)果

采用20 m3發(fā)酵罐進行了3批次試驗，裝料體積占發(fā)酵罐總?cè)莘e的65%。發(fā)酵結(jié)束后，首先進行離心濃縮，然后加入填充劑，再進行噴霧干燥。噴霧干燥的工藝參數(shù)為進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃，此條件下3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果如表1所示。

表1 3批次發(fā)酵液噴霧干燥后菌粉的檢測結(jié)果

項目批次1批次2批次3平均發(fā)酵液體積/L13 65012 87013 56013 360有效菌含量/(×108,cfu/mL)12.012.511.612.0離心漿液體積/L1 2301 2251 3001 251含菌量/(×108,cfu/mL)118.3117.5108.2114.5收率/%88.889.589.489.2噴霧干燥菌粉質(zhì)量/t503.0471.4504.9493.1有效菌含量/(×108,cfu/g)265.4273.7256.4265.1平均收率/%81.580.282.381.3

從表1可知，在進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量為20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃條件下，3批次膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵液噴霧干燥的平均收率為81.3%，平均有效活菌數(shù)達到265.1×108cfu/g。

在上述高濃度膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株菌粉中添加一定比例的輔料可以研制出含菌量為50.0×108cfu/g或100.0×108cfu/g的農(nóng)用微生物肥料制劑菌粉，該制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上可以直接作為肥料使用，也可作為生產(chǎn)微生物菌劑、復(fù)合微生物肥料或生物有機肥的菌粉原料。

2.7 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復(fù)合微生物肥料中的存活性

通過上述方法制備的膠凍樣類芽孢桿菌菌粉與不同復(fù)合肥復(fù)配研制出復(fù)合微生物肥料并在室溫下保存，然后分別在第0、22、56、78和120 d時取樣，采用平板法測定膠凍樣類芽孢桿菌有效菌含量，該菌株在不同復(fù)合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化如圖3所示。

圖3中處理T1、T2、T3、T4、T5的w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%，5個處理的復(fù)合微生物肥料在室溫下保存，隨保存時間的延長，膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈下降趨勢，但在120 d內(nèi)下降量較小，其中T5的有效活菌數(shù)從起始的4.53×108cfu/g降至120 d的3.17×108cfu/g，存活率為89.8%；但從120 d 保存至170 d，除T1外，其他各處理的復(fù)合微生物肥料膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)直線下降。根據(jù)該試驗結(jié)果，可確定所研制出的復(fù)合微生物肥料的保質(zhì)期應(yīng)不超過120 d。

圖3 膠凍樣類芽孢桿菌在不同復(fù)合微生物肥料中的有效活菌數(shù)的變化

農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《復(fù)合微生物肥料》(NY/T 798—2015)中規(guī)定粉劑復(fù)合微生物肥料標(biāo)準(zhǔn)保質(zhì)期為不低于3個月，w(N+P2O5+K2O)不超過25%。該試驗結(jié)果不僅提高了農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中復(fù)合微生物肥料中w(N+P2O5+K2O)不超過25%的規(guī)定，保障了農(nóng)作物營養(yǎng)需求，而且延長了保存期，為復(fù)合微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應(yīng)用提供了有力保證[4]。

通過方差分析進一步研究復(fù)合微生物肥料中N、P2O5、K2O含量和保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 方差分析結(jié)果

源平方和自由度均方F值P(顯著性)時間1 808.0895361.61811.9440.000濃度171.044442.7611.4120.237誤差2 422.0228030.275總計119 892.00090

從表2可知：由于P時間=0.000<0.050?？芍獜?fù)合微生物肥料保存時間對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響達到顯著差異水平；而P濃度=0.237>0.05，說明復(fù)合微生物肥料的N、P2O5和K2O含量對膠凍樣類芽孢桿菌有效活菌數(shù)的影響未達到顯著性差異。

3 結(jié)語

膠凍樣類芽孢桿菌HB- 02菌株發(fā)酵達到終點后，首先將發(fā)酵液轉(zhuǎn)至儲罐，然后進行離心處理，通過離心濃縮和噴霧干燥研制出高含量菌粉，該菌株最佳噴霧干燥條件為進料速率0.75 t/h、通風(fēng)量20 m3/min、進風(fēng)溫度150 ℃。通過對3批次膠凍樣類芽孢桿菌生物量的測定，在該工藝條件下芽孢平均收率在81.3%，平均有效菌數(shù)為265.1×108cfu/g。

w(N+P2O5+K2O)分別為0%、8%、15%、25%和30%的含膠凍樣類芽孢桿菌復(fù)合微生物肥料于室溫下保存，隨保存時間的延長，其有效活菌數(shù)均呈現(xiàn)下降趨勢，但在120 d內(nèi)有效活菌數(shù)下降量較小，存活率基本在90.0%左右；但當(dāng)保存時間從120 d延長至170 d，除不含化肥的處理外，其余各處理的有效活菌數(shù)均呈直線下降。依據(jù)試驗結(jié)果，確定所研制出的復(fù)合微生物肥料的保質(zhì)期為不超過120 d。

通過試驗研究，為膠凍樣類芽孢桿菌菌粉的工業(yè)化原料生產(chǎn)及復(fù)合微生物肥料的研制及保存提供了理論依據(jù)，但其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用效果試驗有待研究。