王雅慧 李 彤 黃 瑩 劉潔霞 王 楓 熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到各種生物和非生物因素的影響。在適應(yīng)外界環(huán)境的過程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。轉(zhuǎn)錄因子是一類能與基因上游特定序列專一性結(jié)合并調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子[1]。轉(zhuǎn)錄因子通過直接或間接作用調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-3]。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)脅迫過程中起重要作用[4]。其中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)[5]。因此分離植物AP2/ERF家族基因并探索其在不同生物及非生物脅迫下的響應(yīng)，對(duì)于進(jìn)一步闡明植物抗逆分子機(jī)理具有重要意義。根據(jù)所含AP2/ERF結(jié)構(gòu)域數(shù)目不同，Sakuma等[6]將AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為AP2、RAV、DREB、ERF 4個(gè)亞族和單獨(dú)亞族成員(soloist)。乙烯響應(yīng)因子(ethylene-responsive factor，ERF)是AP2/ERF家族中一個(gè)重要亞家族，其蛋白質(zhì)序列中含有一個(gè)由60～70個(gè)氨基酸組成的高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域[7]。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過結(jié)合順式作用元件GCC-box(保守序列為GCCGCC)來調(diào)控基因的表達(dá)水平，進(jìn)而參與植物體內(nèi)多種生理反應(yīng)和逆境脅迫響應(yīng)[8]。近年來，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、水稻(Oryzasativa)[10]、油菜(Brassicanapus)[11]、大豆(Glycinemax)[12]等植物中均有關(guān)于ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的研究報(bào)道。

ERF轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ERF轉(zhuǎn)錄因子可以參與激素、蠟質(zhì)、代謝物合成、活性氧清除等多種生物過程[13]。如Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)在番茄和煙草中超表達(dá)ERF2基因可以通過調(diào)控乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑增強(qiáng)植株對(duì)低溫脅迫的耐受力；Gao等[15]發(fā)現(xiàn)在水稻中過量表達(dá)TERF1后增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱和高鹽脅迫的耐受力；Wu等[16]研究表明，JERF3通過結(jié)合GCC-box，激活NtSOD表達(dá)，提高了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，從而提高煙草的耐鹽性；SlERF3能通過降低膜脂過氧化進(jìn)而增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[17]。ERF亞家族是逆境信號(hào)交叉途徑中的連接因子。研究表明，脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)等植物激素可以誘導(dǎo)大豆中9個(gè)不同ERF亞家族基因的表達(dá)，在干旱、低溫和高鹽脅迫下，分別有9、5和9個(gè)ERF亞家族成員基因被誘導(dǎo)表達(dá)，表明ERF家族成員在參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及非生物脅迫響應(yīng)中存在交叉互作[12]。

大量研究表明，ERF家族大部分轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。Ken等[20]采用過量表達(dá)和插入突變體的方法研究了AtERF4對(duì)枯萎病抗性的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AtERF4的植株枯萎病抗性降低，而erf4突變體的抗性增強(qiáng)；Fischer等[21]也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)NtERF5的轉(zhuǎn)基因煙草可以通過限制煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)的復(fù)制來增強(qiáng)其抗性。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子可以通過與下游基因互作并調(diào)控多種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來抵御番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus， TYLCV)的侵染，但不同番茄材料ERF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式不同。因此，不同番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員參與脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理有待進(jìn)一步明確。

本研究以番茄(Solanumlycopersicum)浙雜-301為試驗(yàn)材料，克隆得到AP2/ERF家族ERF亞族的SlERF83和SlERF109基因，并對(duì)其進(jìn)行同源序列比對(duì)、進(jìn)化樹、理化性質(zhì)和三級(jí)結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件等方面的分析；通過酵母單雜交和β-半乳糖苷酶活性測(cè)定驗(yàn)證番茄SlERF83蛋白體外結(jié)合活性；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析SlERF83和SlERF109基因在非生物脅迫、不同激素處理以及番茄黃化曲葉病毒侵染下的表達(dá)，以期為研究番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)生物和非生物脅迫的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料及處理 試驗(yàn)材料番茄浙雜-301于2017年11月種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物生長(zhǎng)室。將四葉期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的番茄植株分別進(jìn)行高鹽(NaCl，200 mmol·L-1)、干旱(PEG，200 g·L-1)、水楊酸(SA，2 mmol·L-1)和茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA，100 μmol·L-1)處理，每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，分別于處理后1、3、6、12、24 h取樣。SA和MeJA溶解于含2%無水乙醇的蒸餾水中，噴灑植株葉片，以用蒸餾水噴灑的葉子為對(duì)照。200 g·L-1PEG和200 mmol·L-1NaCl以灌根方式施入，以灌入等量蒸餾水為對(duì)照。選取生長(zhǎng)至兩葉期的番茄幼苗移至大棚中借助煙粉虱進(jìn)行番茄黃化曲葉病毒的侵染，分別于侵染后2、4、6、7、14、21 d取樣，并迅速浸入液氮中，-80℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和試劑盒 植物總RNA提取試劑盒(RNA simple Total RNA Kit)購自北京天根生化科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒(AxyPrep DNA Gel Extraction Kit)購自江蘇康寧生命科學(xué)有限公司；質(zhì)粒pPC86、大腸桿菌菌株DH5α及酵母菌株EGY48由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體、ExTaq聚合酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT with gDNA Eraser)以及實(shí)時(shí)定量SYBR PremixExTaq試劑盒均購自大連TaKaRa生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成 按照植物總RNA提取試劑盒(RNA simple Total RNA Kit)說明書提取番茄浙雜-301葉片材料總RNA，采用One-Drop OD-1000+超微量核酸分析儀(南京五義科技有限公司)測(cè)定樣品RNA濃度并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime Script RT with gDNA Eraser)說明書將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 番茄SlERF83和SlERF109基因的克隆 根據(jù)番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[22]檢索獲得番茄中SlERF83、SlERF109基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)克隆引物，引物序列詳見表1，以浙雜-301葉片cDNA為模板，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，采用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，連接到pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，進(jìn)行菌液檢測(cè)后送至南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.3 序列分析 在NCBI相關(guān)網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中完成核苷酸和氨基酸序列的BLAST比較搜索和保守域預(yù)測(cè)。將獲得的啟動(dòng)子序列在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析[23]。不同物種間ERF蛋白多重序列比對(duì)及氨基酸疏水性/親水性分析在軟件DNAMAN 6.0中完成。通過SMS序列處理在線工具包(http://www.biosoft.net/sms)及BioXM 2.6軟件進(jìn)行氨基酸理化性質(zhì)和組成成分分析[24]。利用MEGA 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[25]。利用Swiss-Model程序(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)[26]，并通過DS ViewerPro軟件編輯分析模型。在Excel 2013及SPSS20.0軟件中完成熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 酵母單雜交和β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定 設(shè)計(jì)重組引物(詳見表1)，選擇含有色氨酸(Trp)合成基因和半乳糖誘導(dǎo)蛋白(GAL4)激活域的pPC86質(zhì)粒為載體，將其與SlERF83基因連接，轉(zhuǎn)化至能夠合成尿嘧啶(Ura)并含有GCC元件控制的LacZ報(bào)告基因的酵母EGY48中。將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞在SD/-Ura/-Trp固體培養(yǎng)基上28℃倒置培養(yǎng)3 d，利用20 μg·mL-1的X-gal鑒定陽性克隆。挑取X-gal篩選呈藍(lán)色反應(yīng)的菌落于SD/-Ura/-Trp液體培養(yǎng)基中與底物o-硝基-β-D-半乳糖苷共培養(yǎng)進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定。

1.2.5 番茄SlERF83和SlERF109基因的表達(dá)分析 按照SYBR PremixExTaq試劑盒的操作說明，根據(jù)克隆所得的SlERF83和SlERF109基因序列分別設(shè)計(jì)表達(dá)檢測(cè)引物(詳見表1)。選用番茄SlTUB基因?yàn)閮?nèi)參基因[27]，利用CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)及配套軟件進(jìn)行熒光定量PCR操作。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。通過從65℃到95℃逐步擴(kuò)增來獲得熔解曲線。每個(gè)處理樣本設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法[28]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 SlERF83和SlERF109引物序列Table 1 Sequences of SlERF83 and SlERF109 gene primers

注：下劃線表示引物設(shè)計(jì)中的重組序列。

Note：Underline represents the recombinant sequences in primers.

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlERF83和SlERF109基因的克隆

利用RT-PCR方法，以浙雜-301葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到了2個(gè)約700 bp的片段。序列測(cè)定結(jié)果分析表明，SlERF83基因含有1個(gè)678 bp的開放閱讀框，編碼225個(gè)氨基酸；SlERF109基因含有一個(gè)669 bp的開放閱讀框，編碼222個(gè)氨基酸(圖1)。

2.2 番茄SlERF83和SlERF109基因的啟動(dòng)子作用元件分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中分別獲得2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的啟動(dòng)子區(qū)域序列。在PlantCARE中對(duì)其進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)啟動(dòng)子含有數(shù)量相近的核心啟動(dòng)子元件TATA-box和增強(qiáng)子區(qū)域調(diào)控元件CAAT-box。此外，2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子均存在植物激素響應(yīng)相關(guān)元件(ABRE、CGTCA-motif、ERE)、光調(diào)控元件(Box Ⅰ、Box 4)、抗病相關(guān)元件(TC-rich repeats)和熱脅迫相關(guān)元件(HSE)(表2)。

2.3 SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化樹分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)番茄SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，由圖2-A可知，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均具有AP2保守結(jié)合域，分別位于23～84和26～86氨基酸位點(diǎn)之間，符合AP2/ERF家族中ERF亞族的典型結(jié)構(gòu)特征。

圖2 番茄SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子保守域(A)及與其他物種氨基酸序列的多重比對(duì)(B)Fig.2 Conserver domain of SlERF83 and SlERF109 transcription factors (A) and multiple alignment of amino acid sequences in tomato and other different plants (B)

利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)番茄中2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子SlERF83和SlERF109與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、辣椒(Capsicumbaccatum)、煙草(Nicotianatabacum)、葡萄(Vitisvinifera)等13種植物ERF轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。由圖2-B可知，SlERF83和SlERF109的氨基酸序列一致性為43.59%。SlERF83氨基酸序列與馬鈴薯ERF4(XP_006367798.1)一致性高達(dá)91.11%；SlERF109氨基酸序列與煙草ERF5(AAV54033.1)和煙草ERF6(BAJ72665.1)的一致性分別為60.62%和59.27%。不同物種AP2結(jié)構(gòu)域相似度均較高，均具有典型的WLG元件。

選取擬南芥AP2/ERF家族成員與番茄中2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)一步分析番茄SlERF83和SlERF109與AP2/ERF家族成員的進(jìn)化關(guān)系。由圖3可知，番茄SlERF83與SlERF109轉(zhuǎn)錄因子均屬于AP2/ERF家族中ERF亞族的B1組。它們與擬南芥AtERF4(AT3G15210.1)、AtERF8(AT1G53170.1)、AtERF11(AT1G28370.1)關(guān)系最近，共處于同一分支。

2.4 番茄及其他物種ERF轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成與理化性質(zhì)分析

由表3可知，各物種ERF蛋白殘基數(shù)介于211～252之間，相對(duì)分子質(zhì)量介于22.75～27.06 kDa之間，理論等電點(diǎn)介于8.82～10.25之間；酸性氨基酸所占比例基本高于堿性氨基酸，芳香族氨基酸比例介于6.5%～8.8%之間，而脂肪族氨基酸比例介于11.6%～19.1%之間，約為芳香族氨基酸比例的2倍。

表2 番茄SlERF83和SlERF109基因啟動(dòng)子區(qū)域中的部分順式作用元件Table 2 Cis-elements of SlERF83 and SlERF109 promoter regions in tomato

表3 不同植物中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子氨基酸理化性質(zhì)分析Table 3 Analysis of physical and chemical characterization of amino acid sequences of ERF transcription factors among different plants

注：“-”表示無基因登錄號(hào)。

Note:‘-’ indicates no GenBank number.

圖3 番茄SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis on transcription factors of SlERF83 and SlERF109 from Solanum lycopersicum and AP2/ERF family from Arabidopsis thaliana

2.5 番茄SlERF83與SlERF109轉(zhuǎn)錄因子疏水性/親水性分析

對(duì)番茄的2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行疏水/親水性分析，結(jié)果表明，番茄ERF83疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第190位的丙氨酸(Ala)，其次是位于第187位的甘氨酸(Gly)以及位于第151、第152位的纈氨酸(Val)和丙氨酸(Ala)；位于第42位的脯氨酸(Pro)親水性最強(qiáng)，其次是第6位的賴氨酸(Lys)。而ERF109疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第9位的蘇氨酸(Thr)，其次是第12、第13位的甘氨酸(Gly)；第88、第91位的谷氨酸(Glu)和第89位的賴氨酸(Lys)親水性最強(qiáng)。綜上，2個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子均屬于親水性蛋白。

2.6 番茄SlERF83與SlERF109轉(zhuǎn)錄因子三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

番茄SlERF83與SlERF109轉(zhuǎn)錄因子的保守域與擬南芥AtERF1具有較高的相似性，以AtERF1(PDB ID:3gcc)為模型，對(duì)SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。由圖4可知，SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，均有1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊。在結(jié)合域內(nèi)，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的差異位點(diǎn)有4個(gè)，主要集中在α-螺旋上，但差異位點(diǎn)對(duì)其蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)影響不大。

2.7 番茄SlERF83轉(zhuǎn)錄因子在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活活性鑒定

ERF轉(zhuǎn)錄因子可以與GCC-box順式作用元件結(jié)合來調(diào)控基因的表達(dá)。為驗(yàn)證番茄SlERF83轉(zhuǎn)錄因子在酵母中的轉(zhuǎn)錄激活活性，對(duì)其進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，獲得了能在SD/-Ura/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)并在顯色培養(yǎng)基上顯藍(lán)色的酵母菌落(圖5)，表明SlERF83轉(zhuǎn)錄因子可以與GCC-box結(jié)合。進(jìn)一步測(cè)定其β-半乳糖苷酶活性，發(fā)現(xiàn)SlERF83的β-半乳糖苷酶活性是對(duì)照的2.06倍(圖6)。

2.8 番茄SlERF83與SlERF109基因的表達(dá)分析

2.8.1 非生物脅迫 由圖7可知，NaCl處理1 h后，SlERF83和SlER109基因的表達(dá)水平均顯著低于CK，分別為CK的0.28倍和0.46倍，處理3 h和6 h后，表達(dá)水平持續(xù)下降，處理12 h后，表達(dá)量略有升高，但仍低于CK，表達(dá)量分別為CK的0.14倍和0.19倍。PEG脅迫下，處理1和12 h后，SlERF83和SlER109基因的表達(dá)量均顯著低于CK，6 h時(shí)表達(dá)量較CK略微上調(diào)，分別為CK的1.38倍和2.13倍。

2.8.2 激素處理 由圖8可知，SA和MeJA 2種激素處理下SlERF83和SlERF109基因均被誘導(dǎo)表達(dá)。在SA處理下，SlERF83的表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，至處理12 h后表達(dá)量開始下降；SlERF109基因的表達(dá)水平除6 h略低于CK外，其他處理時(shí)間均顯著高于CK。MeJA處理下，SlERF83的表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，6 h時(shí)達(dá)到最高；而SlERF109在12 h時(shí)表達(dá)水平達(dá)到峰值，其他處理時(shí)間下表達(dá)量均較低。

2.8.3 番茄黃化曲葉病毒侵染 由圖9可知，SlERF83和SlERF109基因?qū)Ψ腰S化曲葉病毒的響應(yīng)趨勢(shì)基本一致。侵染前期2個(gè)基因的表達(dá)水平均較低，侵染4 d和6 d后表達(dá)水平均顯著低于CK，侵染7 d后表達(dá)量逐漸上升且均高于CK。其中SlERF83基因的響應(yīng)較為明顯，侵染7、14、21 d后的表達(dá)量分別為CK的4.83倍、1.30倍和1.65倍。

3 討論

圖4 番茄SlERF83和SlERF109轉(zhuǎn)錄因子蛋白的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 The three-dimension structures of SlERF83 and SlERF109 transcription factor in tomato

圖6 番茄SlERF83轉(zhuǎn)錄因子與GCC-box結(jié)合的相對(duì)β-半乳糖苷酶活性Fig.6 Relative β-galactosidase activity of SlERF83 transcription factor with GCC-box

AP2/ERF家族是植物中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛地參與著植物生長(zhǎng)發(fā)育及各種逆境脅迫反應(yīng)的調(diào)控[13]。ERF家族是AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中一個(gè)主要的亞族，含有一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域[6]。本研究克隆得到2個(gè)番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子基因SlERF83和SlERF109，它們均含有一個(gè)由約60個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF家族的ERF亞族。進(jìn)化分析表明，這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子屬于ERF亞族的B1組。氨基酸理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸數(shù)目、相對(duì)分子質(zhì)量以及理論等電點(diǎn)較相似，且均屬于親水性蛋白。三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，SlERF83與SlERF109蛋白AP2結(jié)構(gòu)域相似度較高，僅有4個(gè)差異位點(diǎn)，主要集中在α-螺旋區(qū)域。N-端具有3個(gè)反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)可能參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用[29]。

研究表明，擬南芥AtERF9基因通過結(jié)合下游PDF基因的GCC-box，調(diào)控PDF基因的表達(dá)，從而控制植物對(duì)灰霉病的抗性[30]。此外，ERF轉(zhuǎn)錄因子還可以與VWRE(wound-responsivecis-element)[31]、CE1(coupling element 1)等順式元件結(jié)合[32]，對(duì)不同功能基因進(jìn)行調(diào)控，從而在不同生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[33]。本研究中，酵母單雜交結(jié)果表明，番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子可以識(shí)別下游基因啟動(dòng)子區(qū)域GCC-box順式作用元件，進(jìn)而激活或抑制下游非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note: Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖7 番茄SlERF83和SlERF109基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)水平Fig.7 Expression analysis of SlERF83 and SlERF109 gene in tomato under different abiotic stress treatments

圖8 番茄SlERF83和SlERF109基因在不同激素處理下的表達(dá)水平Fig.8 Expression analysis of SlERF109 gene in tomato under different hormonal treatments

圖9 番茄SlERF83和SlERF109基因在番茄黃化曲葉病毒侵染下的表達(dá)水平Fig.9 Expression analysis of SlERF83 and SlERF109 gene in tomato under TYLCV infection

通過分析SlERF83與SlERF109的啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)，番茄SlERF83與SlERF109基因啟動(dòng)子區(qū)域均具有多種響應(yīng)干旱、高溫等非生物脅迫以及ABA、MeJA等激素的順式作用元件，SlERF83與SlERF109基因在干旱、高鹽脅迫下與對(duì)照相比表達(dá)水平均有所下調(diào)，表明番茄SlERF83與SlERF109基因可能受到多種逆境脅迫誘導(dǎo)，與Zhu等[34]的研究結(jié)果一致。大量研究表明過量表達(dá)干旱或高鹽脅迫相關(guān)ERF基因可以提高煙草、水稻、番茄植株的抗鹽或抗旱能力[15,35-36]。此外，2個(gè)番茄ERF基因在SA處理下均被誘導(dǎo)表達(dá)，而MeJA處理下SlERF83的表達(dá)水平升高、SlERF109的表達(dá)量有所下降，表明ERF轉(zhuǎn)錄因子可以影響不同信號(hào)途徑之間的協(xié)同或拮抗作用[37]。同時(shí)，植物激素在植物抗病防衛(wèi)系統(tǒng)中具有重要作用，ERF轉(zhuǎn)錄因子可通過植物激素相互作用共同調(diào)控非生物脅迫反應(yīng)。番茄黃化曲葉病毒侵染前期，SlERF83與SlERF109基因的表達(dá)水平均較低，這可能與侵染處理中煙粉虱噬咬引起植株創(chuàng)傷誘導(dǎo)相關(guān)。有研究表明，煙粉虱侵染導(dǎo)致番茄黃化曲葉病毒具有一定的時(shí)間滯后性，侵染7 d后，番茄黃化曲葉病毒經(jīng)過多輪復(fù)制，番茄SlERF83與SlERF109基因均被誘導(dǎo)表達(dá)，說明番茄中的ERF轉(zhuǎn)錄因子也參與了對(duì)番茄黃化曲葉病毒的響應(yīng)[38]。ERF基因過量表達(dá)可以提高植物對(duì)某一種病害的抗性[39]，且某些ERF基因過表達(dá)可以使植物對(duì)多種病害表現(xiàn)出抗性，并具有一定的廣譜抗病性[39-40]。本研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物抗逆分子機(jī)理具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，番茄SlERF83和SlERF109均為親水性蛋白，含有一個(gè)保守的AP2結(jié)構(gòu)域，屬于AP2/ERF家族中ERF亞族的B1組；SlERF83與SlERF109啟動(dòng)子區(qū)域含有多種逆境響應(yīng)元件；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示SlERF83和SlERF109都含有1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊；酵母單雜交試驗(yàn)表明SlERF83蛋白可以與GCC-box結(jié)合。在不同生物和非生物脅迫下，SlERF83與SlERF109基因的表達(dá)水平與對(duì)照相比差異明顯，表明番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子可能參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。本研究為深入開展番茄ERF轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)生物和非生物脅迫分子機(jī)理研究提供了理論依據(jù)。