夏張悅懌, 楊丙成, 章飛芳, 梁鑫淼

(華東理工大學藥學院, 制藥工程與過程化學教育部工程研究中心, 上海 200237)

大環(huán)內酯類抗生素(macrolide antibiotics, MACs)是一類廣譜性抗生素,在臨床以及養(yǎng)殖和畜牧業(yè)上均有廣泛使用。但MACs的過量使用以及濫用,使得細菌對其耐藥性不斷增加,殘留的抗生素會隨著動物食品進入人體,對人類健康造成威脅和隱患[1]。因此很多國家都對食品中的MACs設置了最大殘留限量。如中國農(nóng)業(yè)部第235號文件規(guī)定奶類中替米考星和泰樂菌素的最大殘留限量均為50 μg/L[2];歐盟法規(guī)規(guī)定奶類中螺旋霉素和替米考星的最大殘留限量分別為200 μg/L和50 μg/L[3]。目前針對MACs殘留已經(jīng)發(fā)展出了許多配套的分析方法如固相萃取[4]、液液萃取[5]、加速溶劑萃取結合液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)[6]等。固相萃取需要將吸附劑裝填入一個萃取小柱,萃取過程較為繁瑣,且無法適用于大體積樣品處理;液液萃取需要大量有機試劑;質譜檢測則存在使用和后期維護成本高昂,較大基質效應干擾等問題。建立MACs分析方法,有效的樣品前處理是關鍵環(huán)節(jié)。

在眾多的樣品前處理技術中,分子印跡聚合物(molecular imprint polymer, MIP)由于其高選擇性而具有較大的優(yōu)勢。MIP是通過聚合反應在聚合物中形成一個與模板分子結構互補的空腔,在萃取時只有與空腔結構匹配的分子才能被吸附,可有效排除其他物質的干擾,有利于提高萃取的選擇性[7]。目前,MIP在分析化學、藥物檢測和生物傳感器等方面都得到了廣泛的應用[8,9]。但是傳統(tǒng)MIP存在空腔包埋太深和空間位阻等問題,導致模板分子和MIP結合困難以及萃取后不易被洗脫。磁性表面分子印跡聚合物(magnetic surface molecularly imprint polymer, MS-MIP)可以在很大程度上克服上述問題[10]。

Song等[11]以泰樂菌素為模板,甲基丙烯酸為功能單體制備出相應的MIP吸附劑,之后使用LC-MS/MS對動物肌肉中的10種MACs進行了檢測;Song等[12]通過沉淀聚合法制備了以托拉霉素為模板的MIP吸附劑,結合LC-MS/MS實現(xiàn)了豬肉中7種MACs的同時測定。而目前有關用于MACs的MS-MIP吸附劑非常有限,所能檢索到的僅有Zhou等[13]以紅霉素為模板,制備出MS-MIP,結合HPLC-UV應用于食品中多種MACs的檢測。需要指出的是紅霉素屬于十四元MACs,而使用最多的MACs類獸藥是以泰樂菌素和替米考星為代表的十六元抗生素。目前以十六元MACs為模板的MS-MIP吸附劑尚無文獻報道。

本論文以磁性納米顆粒為基質,制備了以替米考星為模板的MS-MIP吸附劑,優(yōu)化了合成與萃取步驟,考察了吸附劑的性能并將其應用于奶粉中MACs殘留的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津LC-20A高效液相色譜儀(包括LC-20AD輸液泵、DGU-20A3R在線脫氣機、SIL-20AC自動進樣器、SPD-20A檢測器、LCsolution色譜工作站);磁鐵(55 mm×50 mm×25 mm);氮吹儀(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);數(shù)顯控溫油浴鍋(德國IKA公司); KH-100E超聲波清洗器(寧波新芝生物科技有限公司); Milli-Q超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

替米考星(tilmicosin, TIL,純度99%)、螺旋霉素(spiramycin, SPI,純度97%)、交沙霉素(josamycin, JOS,純度91.2%)和泰樂菌素(tylosin tartrate, TYL,純度98.9%)均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;磺胺嘧啶(sulfadiazine,純度99%)購自美國Alfa Aesar公司;恩諾沙星(enrofloxacin,純度99%)和鹽酸土霉素(oxytetracycline hydrochloride,純度99%)購自美國Sigma-Aldrich公司;納米Fe3O4(99.5%,約20 nm)購自阿達馬斯試劑有限公司;二甲亞砜(DMSO)購自上海麥克林生物科技有限公司;甲基丙烯酸(MAA)和3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(MPS)購自上海阿拉丁化學試劑有限公司;甲醇和乙腈(均為色譜純)購自美國Tedia公司;以上試劑除特殊指明外均為分析純試劑。

1.2 替米考星-磁性表面分子印跡聚合物的制備

稱取1.0 g納米Fe3O4于三口燒瓶中,加入100 mL去離子水超聲使其分散均勻。緩慢滴加25 mL 1.0 mol/L的九水硅酸鈉溶液,邊滴加邊攪拌,滴加完成后用4 mol/L鹽酸調節(jié)溶液pH至6.0左右,然后80 ℃反應3 h。反應結束后,依次用甲醇和純水清洗產(chǎn)物3遍,最后冷凍干燥得到Fe3O4@SiO2。

取0.5 g干燥后的Fe3O4@SiO2于圓底燒瓶中,加入0.6 mL MPS, 40 mL無水甲苯和0.5 mL吡啶,在N2保護下115 ℃、800 r/min反應24 h。反應結束后依次用甲苯、甲醇洗至無色,干燥后得到Fe3O4@SiO2-MPS。

稱取208.6 mg替米考星和250 μL甲基丙烯酸于圓底燒瓶中,加入40 mL二甲亞砜,于30 ℃、500 r/min條件下預聚合1 h。然后依次加入300 mg Fe3O4@SiO2-MPS, 55 mg偶氮二異丁腈和120 mg聚乙烯吡咯烷酮。N2保護下60 ℃、800 r/min反應24 h。得到的產(chǎn)物用純水和甲醇清洗3遍,60 ℃下干燥12 h后得到MS-MIP吸附劑(其合成路線圖見圖1)。

非分子印跡聚合物(MS-NIP)制備方法同上述MS-MIP,區(qū)別是不使用模板分子。

使用30 mL甲醇-乙酸(80∶20, v/v)溶液,超聲30 min去除模板分子,經(jīng)測定重復洗脫4次可以完全去除模板分子。

圖 1 磁性表面分子印跡聚合物(MS-MIP)的合成路線圖Fig. 1 Synthesis route to magnetic surface molecularly imprint polymer (MS-MIP)

1.3 萃取過程

稱取10 mg MS-MIP吸附劑于錐形瓶中,加入2 mL甲醇超聲活化,再加入20 mL 0.5 mg/L的標準溶液,超聲3 min后靜置30 min,在外加磁場下倒去溶液,加入4 mL乙腈-乙酸(80∶20, v/v)溶液進行洗脫,收集洗脫液吹干,最后加入1 mL甲醇重溶并注入HPLC-UV系統(tǒng)檢測。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱為XCharge C18(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm,華譜新創(chuàng)科技有限公司),柱溫25 ℃;流動相A為0.02%(v/v)磷酸水溶液,B為甲醇,高壓梯度洗脫模式:0～10 min, 10%B～90%B; 10～20 min, 90%B; 20～22 min, 90%B～10%B; 22～32 min, 10%B。進樣體積20 μL,流速1.0 mL/min,檢測波長分別為232 nm和282 nm。

1.5 飽和吸附量和吸附平衡時間測定

考察吸附劑的飽和吸附量,選擇質量濃度分別為0.5、2、5、10、15、20、25 mg/L 的7個替米考星標準溶液為樣品溶液,按照1.3節(jié)中步驟進行萃取。根據(jù)公式(1)[14]計算不同濃度下MS-MIP和MS-NIP的吸附量Qe。

Qe=Ce×V/M

(1)

式中,Qe(mg/g)為不同濃度下吸附劑的吸附量,Ce(mg/L)為TIL經(jīng)氮吹重溶后的質量濃度,V(L)為重溶體積,M(g)為吸附劑質量。

考察吸附劑的吸附平衡時間,萃取過程遵循1.3節(jié)內容,但設置標準溶液質量濃度為1.0 mg/L,改變超聲后的靜置時間為3、15、30、50、70 min,根據(jù)公式(2)[14]計算相應時間下的吸附量。

Qt=Ct×V/M

(2)

式中,Qt(mg/g)為不同靜置時間下吸附劑的吸附量,Ct(mg/L)為TIL經(jīng)氮吹重溶后的質量濃度,V(L)為重溶體積,M(g)為吸附劑用量。

1.6 富集倍數(shù)測定

在3種不同條件下考察吸附劑的富集能力,分別為:將1 mL 0.5 mg/L 的標準溶液直接過膜然后注入液相色譜檢測;用MS-MIP和MS-NIP吸附劑分別對60 mL 0.05 mg/L的標準溶液進行萃取,最后甲醇重溶至200 μL,然后用液相色譜檢測。

MS-MIP對目標分子的富集因子通過公式(3)計算[15]:

EF=C0/C1×A1/A0

(3)

式中,C0和C1分別為標準溶液直接進樣的質量濃度及富集前樣品溶液的質量濃度;A0和A1分別為直接進樣得到的峰面積及富集后的峰面積大小。

1.7 奶粉樣品的前處理

奶粉樣品均購自本地超市。稱取3 g奶粉加入15 mL乙腈,超聲15 min后以10 000 r/min離心15 min,收集上清液旋蒸至干,純水重溶至15 mL后備用。

2 結果與討論

2.1 合成條件和萃取條件的優(yōu)化

模板分子、功能單體和交聯(lián)劑三者之間的比例不同,會導致制得的聚合物在萃取能力上存在差異;另一方面,反應溶劑在分子印跡聚合物制備過程中又作為致孔劑,可以促進印跡空腔的形成,所以其種類選擇非常重要。實驗中以20 mL 0.5 mg/L的替米考星標準溶液作為樣品溶液,萃取過程如1.3中所述。經(jīng)過優(yōu)化,當替米考星與甲基丙烯酸的摩爾比為1∶12時,吸附劑對替米考星的萃取效果最佳(見圖2a);考察了3種常見溶劑乙醇、乙腈和DMSO,結果表明DMSO為反應溶劑時,所得吸附劑萃取效果最佳(見圖2b)。

考慮到MACs具有弱堿性,溶液pH值改變會影響它在水中的電離程度和穩(wěn)定性,因此考察了樣品pH值和洗脫劑用量對4種MACs萃取效果的影響。如圖3a所示,樣品溶液的pH值對4種目標MACs的萃取效果不盡一致,對替米考星而言,pH為7時萃取效果最佳;對螺旋霉素和交沙霉素來說,pH=8.5時萃取效果最好;泰樂菌素在這兩個pH值下的萃取效果幾乎沒有差異。綜合考慮,最終選擇中性條件為萃取條件。選擇乙腈-乙酸(80∶20, v/v)溶液為洗脫劑,考察其用量對萃取的影響,結果表明在4 mL以后萃取效果不再有明顯變化(如圖3b),說明該用量足以將MACs完全洗脫,所以后續(xù)以4 mL為最終洗脫體積。

圖 2 (a)替米考星和甲基丙烯酸的物質的量比以及(b)反應溶劑種類對替米考星萃取的影響(n=3)Fig. 2 Effect of (a) molar ratio between tilmicosin and methacrylic acid and (b) reaction solvent types on the extraction of tilmicosin (n=3)

圖 3 (a)樣品溶液pH以及(b)洗脫劑用量對4種大環(huán)內酯類抗生素萃取的影響(n=3)Fig. 3 Effect of (a) sample pH and (b) eluent volume on the extraction of four MACs (n=3) TIL: tilmicosin; SPI: spiramycin; JOS: josamycin; TYL: tylosin tartrate.

2.2 飽和吸附量和吸附平衡時間考察

替米考星標準溶液初始濃度與吸附量的關系如圖4a所示,隨著濃度的增加,MS-MIP對替米考星的吸附量不斷增加,但在20 mg/L以后,樣品溶液的初始濃度繼續(xù)增加,吸附量沒有顯著變化,此時的飽和吸附量QMS-MIP根據(jù)公式(1)計算得22.80 mg/g,相比之下QMS-NIP僅為10.80 mg/g。這可能是因為MS-MIP中有與替米考星結構匹配的印跡空腔,使得萃取時吸附劑和替米考星更易結合,而MS-NIP的結構不規(guī)則,無法特異性識別替米考星分子。

MS-MIP與MS-NIP的吸附平衡考察如圖4b所示,可以看出,MS-NIP在15 min左右基本可以達到吸附平衡,而MS-MIP達到吸附平衡需要30 min左右。MS-NIP較快的吸附平衡可能是由于其吸附能力比較弱所致。為考察MS-MIP吸附平衡時間的優(yōu)劣,與文獻報道的其他MIP的吸附平衡時間做了對比(見表1)，可以看出，相比其他類似的以抗生素為模板分子制備的MS-MIP以及傳統(tǒng)MIP,本工作制備的MS-MIP吸附平衡用時是可以接受的。

表 1 不同研究中吸附平衡時間的對比Table 1 Comparison of adsorption equilibrium time for MIP in the present report and previous reports

1) Surface molecularly imprinted polymer; 2) traditional molecularly imprinted polymer.

2.3 MS-MIP的選擇性考察

選取和替米考星結構類似的其他3種大環(huán)內酯類抗生素:螺旋霉素、交沙霉素和泰樂菌素,以及與替米考星結構不同的其他3類抗生素:喹諾酮類恩諾沙星、磺胺類磺胺嘧啶和四環(huán)素類鹽酸土霉素,在相同條件下進行萃取,結果見圖5,可以看出,MS-MIP對4種MACs均具有明顯的萃取效果,但對3種非MACs類抗生素萃取作用很弱;相比之下,MS-NIP沒有明顯選擇性,對MACs的萃取效果明顯弱于MS-MIP,相反對磺胺嘧啶,恩諾沙星和鹽酸土霉素的萃取能力優(yōu)于MS-MIP。這也證明了MS-MIP對替米考星及其結構類似物具有較好的選擇性。

圖 4 MS-MIP和MS-NIP的(a)吸附靜態(tài)學和(b)吸附動力學曲線(n=3)Fig. 4 (a) Adsorption static curve and (b) adsorption kinetic curve of MS-MIP and MS-NIP (n=3) NIP: non imprinted polymer.

圖 5 MS-MIP和MS-NIP的選擇性考察(n=3)Fig. 5 Investigation of the selectivities of MS-MIP and MS-NIP (n=3)

2.4 富集倍數(shù)及重復性考察

是否具有良好的富集效果是評判吸附劑的一個重要性能指標。為考察MS-MIP的富集效果,與直接進樣進行了對比,結果見圖6。MS-MIP對SPI、JOS、TIL、TYL的富集倍數(shù)經(jīng)1.6節(jié)中公式(3)計算分別為212、275、675、293倍;使用MS-NIP萃取時,上述4種目標物的富集倍數(shù)分別為99、73、205、69倍。這顯示出MS-MIP對MACs具有較好的富集濃縮能力。

圖 6 MS-MIP和MS-NIP對4種抗生素的富集效果Fig. 6 Enrichment effects of MS-MIP and MS-NIP for the four MACsMobile phase: A, 0.02% (v/v) phosphoric acid; B, MeOH. Gradient elution: 0-10 min, 10%B-90%B; 10-20 min, 90%B; 20-22 min, 90%B-10%B; 22-32 min, 10%B.

稱取10 mg吸附劑,在以水為基質的樣品溶液中按照相同的萃取條件反復萃取6次,發(fā)現(xiàn)每次的萃取結果差異很小(RSD<7.82%),說明吸附劑具有良好的重復利用性,可以至少循環(huán)使用6次。

2.5 奶粉樣品中4種MACs的基質添加標準曲線、檢出限和定量限

在經(jīng)預先檢測不含MACs或含量在檢出限以下的奶粉樣品中添加4種MACs標準品80～800 μg/kg,按優(yōu)化后的萃取參數(shù)進行萃取,每個濃度平行實驗3次,繪制基質添加標準曲線(y為4種MACs的峰面積,x為對應的含量),結果如表2所示,在該范圍內線性關系良好,R2> 0.99。按3倍和10倍信噪比計算檢出限和定量限分別為0.58～1.36 μg/kg和1.92～4.55 μg/kg。

表 2 4種MACs的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)(R2)、檢出限和定量限(n=3)Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs) of the four MACs (n=3)

LOD and LOQ were calculated byS/N=3 and 10, respectively;y: peak area;x: content, μg/kg.

2.6 MACs在奶粉樣品中的加標回收率和精密度

在空白奶粉中分別添加80、200、500 μg/kg的4種MACs混合標準品,進行方法回收率和精密度考察,日內每個濃度平行實驗5次,日間為連續(xù)3天,結果見表3所示,4種MACs的日內和日間回收率和精密度均良好,日內回收率為83.2%～123.0%,精密度為1.6%～10.2%;日間回收率為83.9%～121.0%,精密度為1.4%～12.2%。

由圖7可看出,200 μg/kg加標水平的奶粉經(jīng)過MS-MIP富集后檢測得到的色譜圖中,4種抗生素的色譜峰都非常明顯,但相比2.4節(jié)中的富集效果圖,這里交沙霉素的峰最高,替米考星次之,可能是因為基質不同的原因,前期實驗是在水溶液中進行,而奶粉基質更加復雜,干擾物更多,對奶粉的前處理可能會造成部分抗生素的損失;600 μg/kg加標水平的奶粉經(jīng)簡單處理后直接用液相色譜檢測得到的色譜圖中,4種抗生素中只有交沙霉素和泰樂菌素略有響應,螺旋霉素和替米考星未檢測到;空白奶粉經(jīng)MS-MIP萃取后的液相色譜圖中,4種MACs均未檢出,證明本吸附劑可以用于對奶粉中痕量MACs的有效前處理。

表 3 4種MACs在奶粉樣品中3個加標水平下的回收率及精密度Table 3 Recoveries and precisions of the four MACs spiked in blank milk powder samples at three levels

圖 7 奶粉中4種大環(huán)內酯類抗生素的萃取效果Fig. 7 Extraction effects of the four MACs in milk powder samples Conditions are the same as in Fig. 6.

3 結論

本文報道了一種以替米考星為模板分子的磁性表面分子印跡聚合物吸附劑。該吸附劑對4種十六元的MACs具有良好的選擇性和富集能力,且吸附平衡時間較短,可以結合HPLC-UV應用于奶粉中MACs殘留的檢測,有望應用于其他類型樣品中抗生素痕量殘留的前處理。