劉珊珊，韋 鑫，盛福瑞，喬清華，2,*

(1.玉林師范學(xué)院 生物與制藥學(xué)院，廣西 玉林 537000； 2.山東棉花研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海棉花遺傳改良與栽培生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

植物根際是植物根系-土壤-微生物相互作用形成的特殊土壤微區(qū)域，是土壤微生物與植物根系作用最激烈的區(qū)域，也是植物-土壤-微生物進(jìn)行物質(zhì)交換和能量、信號(hào)傳遞最重要的界面。一方面，作為植物的“第二基因組庫”，根際微生物的活動(dòng)和代謝對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫抗性具有一定的調(diào)節(jié)作用。研究表明，植物根際微生物可以通過調(diào)節(jié)植物的根型[1]、改變土壤特性[2-3]、降解有機(jī)物質(zhì)[3]、降解或者消除有毒物質(zhì)[4-5]、參與碳氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)[6-10]、抑制有害微生物[11]等影響植物的生長(zhǎng)。另一方面，植物通過根系分泌物的輸出直接或者間接影響根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，大量土壤微生物在植物根際富集，并受到根系分泌物的選擇性促進(jìn)或者抑制[12-16]。根際微生物群落的物種和功能多樣性受到多種因素的影響，如植物品種、發(fā)育時(shí)期、生長(zhǎng)環(huán)境等。根際微生物結(jié)構(gòu)和功能的多樣性是衡量植物健康狀況的重要指標(biāo)。

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，棉籽、莖稈，特別是棉纖維是多種生產(chǎn)加工行業(yè)的重要原料。棉花種植過程中因連作或氣候異常導(dǎo)致的土傳病高發(fā)是導(dǎo)致棉花減產(chǎn)的重要原因。了解連作土壤中棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，可為人工干預(yù)調(diào)整棉花根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而調(diào)整棉花的生理周期，降低棉花土傳病發(fā)病率，避免不利氣候因素導(dǎo)致的減產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。本文基于二代測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期找出棉花根際微生物群落結(jié)構(gòu)和功能在不同發(fā)育時(shí)期的變化規(guī)律，揭示棉花各發(fā)育時(shí)期的根際微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料選用陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和海島棉Hai7124，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張?zhí)煺娼淌谔峁?。營(yíng)養(yǎng)土購自濟(jì)南峰園科技有限公司，理化性質(zhì)如下：pH值4.87±0.09，有機(jī)質(zhì)(44.62±3.57)g·kg-1，水解性氮(1.39±0.17)g·kg-1，有效磷(188.37±15.68)mg·kg-1，速效鉀(1.67±0.02)g·kg-1，交換性鈣(2.58±0.15)g·kg-1，交換性鎂(0.69±0.01)g·kg-1，交換性鈉(185.33±3.51)mg·kg-1，有效銅(2.87±0.40)mg·kg-1，有效鋅(5.01±0.98)mg·kg-1，有效鐵(1.20±0.05)g·kg-1，有效錳(222.64±35.34)mg·kg-1。

1.2 棉花種植與取樣

棉花種子經(jīng)濃硫酸脫絨后用活水沖洗5 min，用10%過氧化氫浸泡1 h，然后用滅菌水反復(fù)沖洗3～5次。將種子移至鋪有滅菌濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃避光培養(yǎng)12～24 h。種子萌發(fā)后，播種到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，于組培室28 ℃條件下育苗。待幼苗長(zhǎng)至15 cm左右，轉(zhuǎn)移到預(yù)先消毒過的溫室中培養(yǎng)。溫室為普通塑料大棚日光溫室，培養(yǎng)時(shí)間為5月中旬—7月上旬，利用空調(diào)將最高溫度控制在35 ℃以內(nèi)。每3 d澆一次滅菌水，幼苗期每次每盆澆500 mL，蕾期和花期每次每盆澆1 000 mL。

分別在幼苗期、蕾期、花期取棉花根際土。取樣方法為：將花盆倒扣，倒出土后輕輕抖動(dòng)，抖落多余的土壤，留下附著在根表面1 mm左右的根際土。將根放于裝有滅菌水的50 mL離心管中，用滅菌水反復(fù)沖洗得到根際土懸液。將根際土懸液以10 000 r·min-1的速度離心15 min，倒掉上清液，取沉淀用液氮速凍，-80 ℃冷凍備用。在根際土取樣的同時(shí)，分別取各時(shí)期不種植棉花花盆中的土壤作為相應(yīng)時(shí)期的對(duì)照土，距土表6～15 cm位置取樣。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 DNA提取與測(cè)序分析

1.3.1 DNA提取

采用Omega D5625-02土壤DNA提取試劑盒提取各土壤樣品DNA。用熒光定量?jī)x(美國(guó)Life Qubit 3.0)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA濃度和完整性進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格后用于后續(xù)建庫測(cè)序。

1.3.2 測(cè)序分析

土壤DNA樣品檢測(cè)合格后，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司分別對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子建庫并測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq platform (Illumina， San Diego， CA， USA)。

下機(jī)數(shù)據(jù)通過QIIME軟件進(jìn)行過濾，去除低質(zhì)量的測(cè)序片斷(reads)，得到有效測(cè)序片斷(clean reads)，使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short Reads)v1.2.11軟件對(duì)過濾得到的clean reads進(jìn)行拼接，將有重疊區(qū)域的reads組裝成一條序列(最小匹配長(zhǎng)度15 bp，且重疊區(qū)域允許錯(cuò)配率為0.1)。利用UPARSE軟件在97%相似度下對(duì)所得到的標(biāo)簽(tags)進(jìn)行聚類，得到運(yùn)算分類單元(operational taxonomic units， OUT)代表序列，并利用UCHIME v4.2.40軟件將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從OTU代表序列(16S嵌合體數(shù)據(jù)庫，gold database v20110519；ITS嵌合體數(shù)據(jù)庫，UNITE v20140703)中去除。通過RDP classifer v2.2軟件將OTU代表序列與Greengene(16S)和UNITE(ITS)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，做物種注釋，置信度閾值為0.5。

根據(jù)OTU在每個(gè)樣品的豐度文件，計(jì)算每個(gè)樣品或組別具有的OTU(不考慮OTU豐度，只考慮OTU有無)，通過Venny2.1平臺(tái)(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)做出Venn圖，并找出樣品間或組間共有與特有的OTU。

α多樣性用ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)表示，通過Mothur v1.31.2軟件計(jì)算樣品的α多樣性值，計(jì)算公式參見http://www.mothur.orgwikiCalculators，并基于所得數(shù)據(jù)做出相應(yīng)的稀釋曲線圖。其中，ACE指數(shù)反映樣品中群落的物種豐富度；Simpson指數(shù)反映群落的多樣性，受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響。

β多樣性通過QIIME v1.80軟件計(jì)算。首先，對(duì)每個(gè)樣品的序列數(shù)進(jìn)行統(tǒng)一：每個(gè)樣品按所有樣品中序列數(shù)最少的樣品的序列數(shù)隨機(jī)抽取序列，生成新的OTU table biom文件。使用統(tǒng)一處理后的文件，用Bray-Curtis指數(shù)、UniFrac指數(shù)來衡量樣品的β多樣性。Bray-Curtis指數(shù)在計(jì)算時(shí)不考慮序列間的進(jìn)化距離，只考慮樣品中的物種存在情況，值越大表示樣品間的差異越大。UniFrac指數(shù)利用系統(tǒng)進(jìn)化的信息來比較樣品間的物種群落差異，考慮序列間的進(jìn)化距離，與樣品間的差異呈正相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果

分別對(duì)陸地棉TM-1和海島棉Hai7124的3個(gè)發(fā)育時(shí)期的根際和對(duì)照土細(xì)菌16S rDNA V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。16S rDNA V4區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序共得到2 985 104對(duì)reads，過濾后的clean reads數(shù)為2 776 140對(duì)，拼接后共得到2 759 736個(gè)tags，拼接后的tags經(jīng)過優(yōu)化后在97%的相似度下聚類為12 384個(gè)用于物種分類的OTUs，平均每個(gè)樣品(2 880±1 708)個(gè)。真菌ITS1區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序共得到1 312 315對(duì)reads，過濾后的clean reads數(shù)為1 061 184對(duì)，拼接后共得到894 048個(gè)tags，拼接后的tags經(jīng)過優(yōu)化后在97%的相似度下聚類為991個(gè)用于物種分類的OTUs，平均每個(gè)樣品(158±38)個(gè)。由圖1可以看出，各樣品的稀釋曲線已趨于平緩，說明測(cè)序深度已足夠，基本覆蓋樣品中的所有物種。

2.2 棉花根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期根際和對(duì)照土的細(xì)菌OTU數(shù)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，棉花根際細(xì)菌OTU數(shù)量(1 700±656)極顯著(P<0.01)低于對(duì)照土(5 127±156)。不同發(fā)育時(shí)期對(duì)照土壤中細(xì)菌OTU數(shù)量沒有顯著差異，而根際土壤中細(xì)菌OTU數(shù)量在不同發(fā)育時(shí)期存在顯著變化，蕾期的OTU總數(shù)(2 528±327)顯著(P<0.05)高于苗期(1 251±527)和花期(1 488±75)。

定義2 一個(gè)離散時(shí)間馬爾科夫鏈(Discrete-Time Markov Chain,DTMC)是一個(gè)四元組C=(S,P,ιinit,L).其中:

使用ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌α多樣性進(jìn)行分析。如圖2所示，不同發(fā)育時(shí)期對(duì)照土細(xì)菌群落ACE指數(shù)沒有顯著差異，且對(duì)照土細(xì)菌群落ACE指數(shù)極顯著(P<0.01)大于根際。不同發(fā)育時(shí)期的根際細(xì)菌群落ACE指數(shù)存在顯著差異：蕾期(3 083±278)極顯著(P<0.01)高于苗期(1 423±299)和花期(1 877±110)。不同棉花品種的根際細(xì)菌ACE指數(shù)沒有顯著差異。

A，細(xì)菌ACE指數(shù)；B，細(xì)菌Simpson指數(shù)；C，真菌ACE指數(shù)；D，真菌Simpson指數(shù)。圖例中：S，苗期；B，蕾期；F，花期；T，陸地棉TM-1；H，海島棉Hai7124；C，對(duì)照土。圖例中字母后方的數(shù)字表示重復(fù)。下同。A， ACE index of bacteria; B: Simpson index of bacterial; C， ACE index of fungal; D， Simpson index of fungal. In legends: S， Seedling sage; B， Budding stage; F， Flowering stage; T， TM-1; H， Hai7124; C， Control. The numbers in legends represented replicates. The same as below.圖1 棉花根際和對(duì)照土測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing result of rhizosphere and control soil samples

圖2 兩個(gè)棉花品種不同發(fā)育時(shí)期根際和對(duì)照土細(xì)菌群落ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)Fig.2 ACE and Simpson index of rhizosphere and control soil bacterial community in different growth stages of two cotton cultivars

各時(shí)期根際細(xì)菌Simpson指數(shù)均顯著(P<0.05)大于相應(yīng)對(duì)照土。不同發(fā)育時(shí)期對(duì)照土細(xì)菌群落間的Simpson指數(shù)無顯著差異，但根際細(xì)菌群落Simpson指數(shù)間存在顯著差異：蕾期(0.002 5±0.000 1)顯著(P<0.05)小于花期(0.002 8±0.000 4)和苗期(0.003 7±0.002 0)。兩種棉花品種的根際細(xì)菌Simpson指數(shù)在苗期和花期存在顯著差異(P<0.05)，均表現(xiàn)為海島棉大于陸地棉。

使用Bray-Curtis、UniFrac指數(shù)對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期根際與對(duì)照土的細(xì)菌群落β多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Bray-Curtis指數(shù)分析表明，根際與對(duì)照土的細(xì)菌群落Bray-Curtis指數(shù)在蕾期(TM-1，0.95±0.01；Hai7124，0.95±0.01)極顯著(P<0.01)小于苗期(TM-1，0.97±0.02；Hai7124，0.99±0.01)和花期(TM-1，0.98±0.01；Hai7124，0.97±0.01)。陸地棉苗期與蕾期的Bray-Curtis指數(shù)(0.47±0.11)顯著(P<0.05)低于蕾期與花期的Bray-Curtis指數(shù)(0.55±0.08)，而海島棉苗期與蕾期的Bray-Curtis指數(shù)(0.57±0.10)和蕾期與花期的Bray-Curtis指數(shù)(0.52±0.09)之間無顯著差異。UniFrac指數(shù)分析表明，根際與對(duì)照土細(xì)菌群落之間的UniFrac指數(shù)在蕾期(TM-1，0.80±0.01；Hai7124，0.81±0.01)極顯著(P<0.01)小于苗期(TM-1，0.86±0.05；Hai7124，0.87±0.03)和花期(TM-1，0.86±0.01；Hai7124，0.84±0.02)。陸地棉苗期與蕾期的UniFrac指數(shù)和蕾期與花期的UniFrac指數(shù)無顯著差異，但海島棉苗期與蕾期的UniFrac指數(shù)(0.64±0.05)極顯著(P<0.01)高于蕾期與花期的UniFrac指數(shù)(0.58±0.03)。

對(duì)OTU進(jìn)行聚類分析，得到不同發(fā)育時(shí)期棉花根際和對(duì)照土的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(圖3)。變形菌門(Proteobacteria)在根際土壤細(xì)菌群落中的相對(duì)豐富最高，為47.37%～63.00%，其次為酸桿菌門(Acidobacteria)(5.74%～12.38%)、厚壁菌門(Firmicutes)(1.82%～11.03%)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)(2.60%～6.14%)、放線菌門(Actinobacteria)(2.47%～6.35%)、浮霉菌門(Planctomycetes)(4.11%～6.59%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(4.04%～6.97%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.72%～6.36%)等。與對(duì)照土相比，根際土中各菌門的相對(duì)豐度受到不同的影響，且不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)豐度顯著變化的菌門存在差異(表1)。

圖3 棉花根際和對(duì)照土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成(門水平)Fig.3 Bacterial community structure of cotton rhizosphere and control soil in phylum level

表1 不同時(shí)期在陸地棉和海島棉根際土中相對(duì)豐度與對(duì)照土有顯著(P著(P < 0. 05) 差異的細(xì)菌群落( 門水平)

Table 1 Bacterial communities with significantly (P< 0. 05) different relative abundance in upland cotton and island cotton rhizosphere and control soil in different growth stages in phylum level

差異方向Variation direction苗期Seedling stage蕾期Budding stage花期Flowering stage較對(duì)照土相對(duì)豐度升高Higher than incontrol soil Proteobacteria; ActinobacteriaProteobacteria; Firmicutes;Cyanobacteria; Bacteroidetes;ChlorobiProteobacteria; Cyanobacteria; Chlorobi較對(duì)照土相對(duì)豐度降低Lower than incontrol soilAcidobacteria; Armatimonadetes; BHI80-139; BRC1; Chloroflexi; Cre-narchaeota; Elusimicrobia; Euryarcha-eota; Fibrobacteres; Gemmatimonade-tes; GN02; Nitrospirae; NKB19; OP3; Parvarchaeota; Planctomycetes; SBR1093; Thermi; WS2; WS3AC1; Acidobacteria; Armatimonade-tes; BHI80-139; BRC1; Chloroflexi; Crenarchaeota; Elusimicrobia; Eur-yarchaeota; Fibrobacteres; GAL15; Gemmatimonadetes; GN02; Nitrospi-rae; NKB19; Parvarchaeota; Planc-tomycetes; SBR1093; WS3Acidobacteria; BHI80-139; BRC1; Cren-archaeota; Elusimicrobia; Euryarchaeota; Fibrobacteres; GAL15; Gemmatimonade-tes; GN02; Nitrospirae; NKB19; OD1; OP3; Parvarchaeota; Planctomycetes; SBR1093; WPS-2; WS2; WS3

2.3 棉花根際真菌群落結(jié)構(gòu)在不同發(fā)育時(shí)期的動(dòng)態(tài)變化

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期根際和對(duì)照土的真菌OTU數(shù)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)棉花各發(fā)育時(shí)期根際真菌OTU數(shù)量(149±29)極顯著(P<0.01)低于對(duì)照(186±18)。不同發(fā)育時(shí)期所取對(duì)照土中真菌OTU數(shù)量存在顯著(P<0.05)變化：蕾期真菌OTU數(shù)量(205±7)大于苗期(184±11)和花期(169±8)。根際土壤中真菌OTU數(shù)量在不同發(fā)育時(shí)期也存在顯著(P<0.05)變化：蕾期的OTU總數(shù)(178±16)高于苗期(125±30)和花期(144±6)。

使用ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際真菌α多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖4)。ACE指數(shù)分析表明，不同發(fā)育時(shí)期對(duì)照土真菌群落ACE指數(shù)存在顯著差異(P<0.05)，蕾期最高。對(duì)照土真菌群落ACE指數(shù)顯著(P<0.05)大于根際。不同發(fā)育時(shí)期的根際真菌群落多樣性分析表明，棉花根際真菌群落ACE指數(shù)在蕾期(192±17)顯著(P<0.05)高于苗期(138±22)和花期(154±8)。不同棉花品種相同發(fā)育時(shí)

圖4 兩個(gè)棉花品種不同發(fā)育時(shí)期根際和對(duì)照土的真菌群落ACE指數(shù)和Simpson指數(shù)Fig.4 ACE and Simpson index of rhizosphere and control soil bacterial community in different growth stages of two cotton cultivars

期的ACE指數(shù)間沒有顯著差異。不同發(fā)育時(shí)期的根際和對(duì)照土真菌群落Simpson指數(shù)分析表明，不同發(fā)育時(shí)期的對(duì)照土或根際土真菌群落Simpson指數(shù)間無顯著差異，各時(shí)期根際真菌Simpson指數(shù)均顯著(P<0.05)大于對(duì)應(yīng)對(duì)照土。

分別使用Bray-Curtis和UniFrac指數(shù)對(duì)棉花不同發(fā)育時(shí)期的根際真菌群落和根際與對(duì)照土間的β多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Bray-Curtis指數(shù)分析表明，陸地棉根際與對(duì)照土真菌群落間的Bray-Curtis指數(shù)在不同發(fā)育時(shí)期間無顯著差異，而海島棉根際與對(duì)照土真菌群落間的Bray-Curtis指數(shù)在蕾期(0.98±0.01)顯著(P<0.05)大于花期(0.97±0.01)。UniFrac指數(shù)分析表明，海島棉根際與對(duì)照土真菌群落間的UniFrac指數(shù)由苗期(0.87±0.03)、蕾期(0.76±0.01)到花期(0.71±0.01)極顯著(P<0.01)降低。另外，海島棉苗期與蕾期的UniFrac指數(shù)(0.66±0.06)顯著(P<0.05)大于蕾期與花期的UniFrac指數(shù)(0.63±0.02)。

2.4 發(fā)育時(shí)期對(duì)棉花根際細(xì)菌和真菌菌屬的影響

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期棉花根際和對(duì)照土中細(xì)菌和真菌的群落組成在屬水平上進(jìn)行分析和比較，得到差異顯著的菌屬(表2～3)。其中，Burkholderia、Bradyrhizobium、Bdellovibrio等10個(gè)細(xì)菌菌屬在3個(gè)發(fā)育時(shí)期根際土中的相對(duì)豐度均顯著(P<0.05)高于對(duì)照土，Sinorhizobium、Novosphingobium、Lysobacter、Nitrospira、Planctomyces、Candidatus_Nitrososphaera等13個(gè)細(xì)菌菌屬和Retroconis、Gliomastix、Mortierella等5個(gè)真菌菌屬在3個(gè)發(fā)育時(shí)期根際土中的相對(duì)豐度均顯著(P<0.05)

圖5 棉花根際和對(duì)照土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)組成(門水平)Fig.5 Fungal community structure of cotton rhizosphere and control soil in phylum level

低于對(duì)照土。只在棉花苗期和蕾期根際土壤中相對(duì)豐度顯著顯著(P<0.05)高于對(duì)照土的有Mesorhizobium、Arthrobacter、Dyella等4個(gè)細(xì)菌菌屬和Fusarium、Guehomyces兩個(gè)真菌菌屬，顯著(P<0.05)低于對(duì)照土的有1個(gè)細(xì)菌菌屬(OR-59)和Gibberella、Verticillium兩個(gè)真菌均屬。只在棉花蕾期和花期根際土壤中相對(duì)豐度顯著(P<0.05)高于對(duì)照土的有Aquicella、Legionella、Phenylobacterium等4個(gè)細(xì)菌菌屬和Rhodosporidium、Sakaguchia兩個(gè)真菌菌屬，顯著低于對(duì)照土的有Pseudoxanthomonas、Paenibacillus兩個(gè)細(xì)菌菌屬和Rhodotorula、Engyodontium兩個(gè)真菌菌屬。此外，每個(gè)時(shí)期的根際土壤中都有其特有的與對(duì)照土相比相對(duì)豐度顯著(P<0.05)升高或降低的菌屬，詳見圖6。

3 討論

根系能夠通過改變土壤特性，如保水性[16]、酸堿度[17]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18-19]等條件形成特定的土壤環(huán)境，從而間接導(dǎo)致其對(duì)特定微生物選擇性的促進(jìn)或者抑制作用。另外，植物還可以通過向土壤環(huán)境釋放根系分泌物，如揮發(fā)性物質(zhì)、邊緣細(xì)胞、高分子聚合物等直接影響根際微生物群落結(jié)構(gòu)，選擇性地促進(jìn)或者抑制特定土壤微生物的生長(zhǎng)和繁殖[14，20-22]，而且同種植物不同發(fā)育時(shí)期的根系分泌物種類和性質(zhì)存在差異[15]。本研究表明，與對(duì)照土相比，根際細(xì)菌和真菌的OTU總數(shù)和物種多樣性顯著降低，說明棉花根系會(huì)抑制土壤中特定真菌和細(xì)菌的繁殖，受抑制菌群的豐度降低甚至消失，使棉花根際真菌和細(xì)菌的豐富度降低。在根際土中，細(xì)菌和真菌的物種多樣性在蕾期顯著高于苗期和花期，推測(cè)可能是因?yàn)槭艿矫藁ɡ倨诟捣置谖镏心承┨赜谐煞值拇龠M(jìn)作用而致。

表2 不同時(shí)期在陸地棉和海島棉根際土中相對(duì)豐度與對(duì)照土有顯著(P< 0. 05) 差異的細(xì)菌群落( 屬水平)

Table 2 Bacterial communities with significantly (P< 0. 05) different relative abundance in upland cotton and island cotton rhizosphere and control soil in different growth stages in genus level

差異方向Variation direction苗期Seedling stage蕾期Budding stage花期Flowering stage較對(duì)照土相對(duì)豐度升高Higher than incontrol soilBurkholderia; Lactococcus; Rho-danobacter; Devosia; Carludovica; Bradyrhizobium; Bdellovibrio; Dyel-la; Paenibacillus; Rhodoplanes; My-cobacterium; Methylovirgula; Alkani-bacter; Mesorhizobium; ArthrobacterBurkholderia; Lactococcus; Rhodo-planes; Carludovica; Devosia; Rho-danobacter; Bradyrhizobium; Pheny-lobacterium; Aquicella; Bdellovibrio; Hyphomicrobium; A17; Acidopila; Alkanibacter; Arthrobacter; Mesorhi-zobium; Methylovirgula; Dyella; Le-gionella; Mycobacterium; Thiobacil-lus; Luteimonas; MethylibiumBurkholderia; Rhodanobacter; Devosia; Rhodoplanes; Bradyrhizobium; Carludovi-ca; Phenylobacterium; Streptomyces; Aquicella; Mycobacterium; Acidopila; Candidatus_Koribacter; Methylovirgula; Legionella; Bdellovibrio; Agrobacterium; Alkanibacter 較對(duì)照土相對(duì)豐度降低Lower than incontrol soilRalstonia; Chitinophaga; Rhizobium; Sinorhizobium; Novosphingobium; Lute-olibacter; Candidatus_Xiphinematobact-er; OR-59; Niastella; Variovorax; Fla-visolibacter; Rubrivivax; Opitutus; Ly-sobacter; A17; Sphingomonas; Nitrospi-ra; Steroidobacter; Pirellula; Gemma-ta; Kaistobacter; Planctomyces; Candi-datus_NitrososphaeraNovosphingobium; Pseudoxanthomonas; Sinorhizobium; Luteolibacter; OR-59; Niastella; Paenibacillus; Lysobacter; Sphingomonas; Kaistobacter; Nitrospi-ra; Steroidobacter; Gemmata; Pirel-lula; Planctomyces; Candidatus_Ni-trososphaeraTepidimonas; Novosphingobium; Pseudox-anthomonas; Luteimonas; Candidatus_Xi-phinematobacter; Sinorhizobium; Luteoli-bacter; Paenibacillus; Variovorax; Nias-tella; Rubrivivax; Opitutus; Flavisolibact-er; Lysobacter; Sphingomonas; Nitrospira; Kaistobacter; Steroidobacter; Gemmata; Pirellula; Planctomyces; Candidatus_Ni-trososphaera

表3 不同時(shí)期在陸地棉和海島棉根際土中相對(duì)豐度與對(duì)照土有顯著(P< 0. 05) 差異的真菌群落( 屬水平)

Table 3 Fungal communities with significantly (P< 0. 05) different relative abundance in upland cotton and island cotton rhizosphere and control soil in different growth stages in genus level

差異方向Variation direction苗期Seedling stage蕾期Budding stage花期Flowering stage較對(duì)照土相對(duì)豐度升高Higher than incontrol soil Fusarium; Guehomyces; Rhodotorula; Pseudeurotium Panaeolus; Fusarium; Rhodosporidi-um; Trichoderma; Guehomyces; Chaetomium; Emericella; Mrakia; Kurtzmanomyces; SakaguchiaTalaromyces; Rhodosporidium; Lecanicil-lium; Sakaguchia較對(duì)照土相對(duì)豐度降低Lower than incontrol soilCeratobasidium; Wardomyces; Campylo-carpon; Stephanonectria; Simplicillium; Acremonium; Aspergillus; Stachybotrys; Gibberella; Metarhizium; Verticillium; Retroconis; Gliomastix; MortierellaRhodotorula; Cochliobolus; Zopfiella; Campylocarpon; Gibberella; Humico-la; Wardomyces; Verticillium; Retro-conis; Gliomastix; Engyodontium; Penicillium; MortierellaTetracladium; Campylocarpon; Rhodotoru-la; Tremellodendron; Wardomyces; Crypto-coccus; Retroconis; Engyodontium; Glio-mastix; Mortierella

綠色代表苗期，紅色代表蕾期，橙色代表花期。Green circles represented seedling stage; red circle represented budding stage; orange circle represented flowering stage.圖6 不同發(fā)育時(shí)期特有的根際土壤中與對(duì)照土相比相對(duì)豐度顯著升高(A、C)或降低(B、D)的細(xì)菌(A、B)和真菌(C、D)菌屬及其數(shù)量Fig.6 Bacteria (A， B) and fungi (C， D) with significantly higher (A， C) or lower (B， D) relative abundance in rhizosphere soils than in control soil at different growth stages

大量研究表明，同種植物不同品種的根際微生物在數(shù)量和組成方面存在一定差異[23-25]。本研究表明，海島棉和陸地棉不同發(fā)育時(shí)期根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化特征存在差異：海島棉根際細(xì)菌Simpson指數(shù)在苗期和花期顯著大于陸地棉，但ACE指數(shù)沒有顯著差異，說明陸地棉和海島棉在苗期和花期的根際細(xì)菌物種豐富度無差異，而均勻度陸地棉大于海島棉，推測(cè)可能是因?yàn)楹u棉根際細(xì)菌中的某些菌群在苗期和花期受到了特異性的促進(jìn)或者抑制作用，這部分受到促進(jìn)或者抑制的菌群可能與海島棉某些功能或者特性相關(guān)；陸地棉苗期與蕾期的Bray-Curtis指數(shù)顯著低于蕾期與花期的Bray-Curtis指數(shù)，但UniFrac指數(shù)無顯著差異，說明雖然陸地棉蕾期與花期的根際細(xì)菌群落物種組成差別較大，但是造成其差異的菌種進(jìn)化距離較近；海島棉苗期與蕾期的Bray-Curtis指數(shù)和蕾期與花期的Bray-Curtis指數(shù)之間無顯著差異，UniFrac指數(shù)極顯著降低，說明導(dǎo)致海島棉苗期和蕾期根際細(xì)菌群落差異的菌種之間進(jìn)化距離更遠(yuǎn)。綜上所述，棉花苗期與蕾期的根際細(xì)菌群落差異菌群進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，推測(cè)海島棉苗期和蕾期的根際細(xì)菌群落功能差異更大，因蕾期α多樣性更高，推測(cè)蕾期根際細(xì)菌的功能更多。

棉花根際真菌群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，不同發(fā)育時(shí)期對(duì)照土真菌群落受外界環(huán)境的影響顯著，因此在對(duì)根際真菌群落進(jìn)行分析時(shí)，必須考慮因土壤自身?xiàng)l件改變而導(dǎo)致的真菌群落結(jié)構(gòu)變化。棉花不同發(fā)育時(shí)期根際真菌群落α多樣性分析結(jié)果表明，蕾期雖然根際真菌物種豐富度最高，但是均勻度較低，推測(cè)棉花根際真菌中特定菌群受到了特異性的促進(jìn)或抑制，這部分菌群可能與棉花蕾期某些功能或特性相關(guān)。棉花根際與對(duì)照土的β多樣性分析結(jié)果表明，3個(gè)時(shí)期根際與對(duì)照土真菌之間差異物種的數(shù)量沒有顯著差異，但是蕾期差異物種的進(jìn)化距離較近。綜上所述，推測(cè)棉花根際真菌在蕾期受到促進(jìn)的菌群為進(jìn)化距離較近的特定分類菌群。

已有研究表明，Proteobacteria、Acidobacteria、Planctomycetes、Bacteroidetes為棉花根際細(xì)菌群落相對(duì)豐度較高的優(yōu)勢(shì)菌門[26-27]。陸地棉和海島棉根際細(xì)菌群落中各發(fā)育時(shí)期Proteobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Actinobacteria、Planctomycetes、Bacteroidetes和Verrucomicrobia為相對(duì)豐度最高的8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，約占棉花根際細(xì)菌群落相對(duì)豐度的71.29%～91.50%。Proteobacteria在根際的相對(duì)豐度在3個(gè)發(fā)育時(shí)期都高于對(duì)照土。BRC1、Crenarchaeota、Elusimicrobia等菌門在根際的相對(duì)豐度在3個(gè)發(fā)育時(shí)期都顯著低于對(duì)照土。不同發(fā)育時(shí)期根際細(xì)菌與對(duì)照土相比相對(duì)豐度顯著升高的菌門在各發(fā)育時(shí)期存在差異，除了共有菌門之外，每個(gè)發(fā)育時(shí)期還有其特有菌門，如Actinobacteria在苗期，Cyanobacteria、Bacteroidetes等在蕾期，Cyanobacteria、Chlorobi在花期的相對(duì)豐度在根際土中顯著大于對(duì)照土，而Thermi在苗期，AC1在蕾期，OD1、WPS-2在花期的相對(duì)豐度在根際土中顯著低于對(duì)照土。根際真菌群落中除了Unclassified(未分類)之外，相對(duì)豐度最高的菌門為Ascomycota，其次為Basidiomycota和Zygomycota，三者合為陸地棉和海島棉根際真菌的3大主導(dǎo)菌門。進(jìn)一步分析表明，Rhodanobacter、Devosia、Bradyrhizobium、Bdellovibrio等與有機(jī)物質(zhì)降解、物質(zhì)循環(huán)、生物防治等相關(guān)的菌屬在棉花根際各發(fā)育時(shí)期的相對(duì)豐度都顯著大于對(duì)照土，而Novosphingobium、Sphingomonas、Nitrospira等與解磷、硝化和致病等相關(guān)的菌屬在棉花根際各發(fā)育時(shí)期的相對(duì)豐度則都顯著低于對(duì)照土。此外，對(duì)各發(fā)育時(shí)期受到顯著促進(jìn)和抑制作用的菌屬進(jìn)行分析表明，蕾期相對(duì)豐度在根際土中大于對(duì)照土的菌屬比其他2個(gè)時(shí)期要多，其中，Hyphomicrobium與有機(jī)物質(zhì)的降解和反硝化功能相關(guān)[28]，Thiobacillus在好養(yǎng)條件下有反硝化特性并與硫循環(huán)和吸收相關(guān)[29]，Methylibium與尿素等有機(jī)物質(zhì)的降解有關(guān)[30]，Trichoderma有生物防治功能并與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收相關(guān)[31]，Chaetomium為生物防治、抗旱、氮磷鉀吸收相關(guān)菌屬[32-35]，推測(cè)這些菌屬的富集與蕾期棉花的生長(zhǎng)發(fā)育特性相關(guān)。

總的來看，棉花對(duì)土壤微生物群落具有一定的選擇作用，其根際微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性，不同發(fā)育時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌門相同，細(xì)菌為Proteobacteria、Acidobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria、Actinobacteria、Planctomycetes、Bacteroidetes和Verrucomicrobia，真菌為Ascomycota、Basidiomycota和Zygomycota。不同發(fā)育時(shí)期根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，蕾期與其他2個(gè)時(shí)期的差異最為明顯，大量的與物質(zhì)循環(huán)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和生物防治相關(guān)的功能菌屬在蕾期相對(duì)豐度增加，這些菌群與棉花的相互作用有待進(jìn)一步研究。