彭 帥，陳 朗，鄭天宇，陸會寧，張 麗，劉麗霞

(西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為動物機體重要的模式識別受體(pattern recognition receptors)，廣泛存在于免疫細胞表面，如單核細胞、巨噬細胞等[1]，并且在上皮細胞、牛胚氣管細胞等非免疫細胞中同樣具有很強的活性[2]。自第一個Toll樣受體于1997年被Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)以來，迄今已有十余個家族成員[4]，它們通過識別病原體相關的分子模式(PAMPs)及某些內源性配體，引起信號轉導并誘導特定的免疫效應分子釋放(如炎癥細胞因子)，是固有免疫防御中的重要分子，最終可激活適應性免疫應答[5]。TLR2屬于TLRs家族成員之一，是一種具有識別病原相關分子模式和信號轉導功能的跨膜受體蛋白，Mcguire等[6]將牛TLR2基因定位于17號染色體上。TLR2基因在機體中廣泛分布，且在調控免疫機制方面具有重要作用，使其成為了?？共∮N的候選基因之一。

TLR2具有較高的多態(tài)性，近年來，有關牛TLR2基因多態(tài)性及其與疾病的相關性研究已有大量報道。周峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)，南陽黃牛TLR2基因相比荷斯坦牛發(fā)生了16個堿基突變。孫麗萍[8]研究表明，牛TLR2基因存在3個突變位點，且感染嚴重的乳區(qū)TLR2基因表達量明顯增加。董慧敏[9]、葉小康[10]研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物感染奶牛子宮后TLR2基因mRNA表達量明顯增加，并分析了其與子宮內膜炎的關聯(lián)性。Bhaladhare等[11]發(fā)現(xiàn)，牛TLR2基因存在3個SNP位點，并分析了其與結核病的相關性。楊永江等[12]發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在6個SNP位點。這些研究表明，牛TLR2基因具有高度多態(tài)性，并與許多免疫性疾病有密切關聯(lián)，但有關大通牦牛TLR2基因的研究國內外還未見報道。

大通牦牛是分布于青海等地的特有品種，體格結實，體型相對緊密，肉用性能強，發(fā)育狀況良好，因此引起了人們的廣泛關注[13]。本實驗以大通牦牛為研究對象，采用DNA混合池擴增后直接測序的方法對大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的SNP位點(單核苷酸多態(tài)性位點，single nucleotide polymorphism site)進行篩選分析，并對其進行生物信息學分析，為大通牦牛TLR2基因的深入研究和抗病育種提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 血樣采集

大通牦牛血樣采自青海大通牦牛種牛場，以隨機抽樣的方法，對55頭大通牦牛進行頸靜脈采集全血10 mL，加ACD抗凝劑抗凝，利用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[14]。基因組DNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2 引物設計與合成

參照GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的奶牛TLR2基因序列(登錄號AF368419)和周峰等[7]已經(jīng)設計好的TLR2基因特異性引物，分成五段進行擴增，預期擴增片段長度分別為522、822、574、526、599 bp。引物序列分別為：F1: 5′-GGACAATGCCACGTGCTT-3′，R1: 5′-GCACTGATCTCAAGCTCCTCAAG-3′；F2: 5′-TGAGGAGCTTGAGATCAGTG-3′，R2: 5′-ACTGTGTATCCTTGTGCTGG-3′；F3: 5′-CCTAGGTAATGTGGAGACG-3′，R3: 5′-AAGGAGGCATCTGGTAGAG-3′；F4: 5′-CCAGCACAAGGATACACAGT-3′，R4: 5′-CTTCATGTACCACAGTCCGT-3′；F5: 5′-TTCCTGTTGCTCCTGCTCAC-3′，R5: 5′-GACCACCACCAGACCAAGAC-3′。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 DNA混合池構建與PCR擴增

55個大通牦牛基因組DNA樣品構建一個DNA混合池，以DNA混合池為模板進行擴增。PCR擴增體系為：DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×PowerTaqPCR Master Mix (百泰克)11 μL，加ddH2O到20 μL。PCR反應過程：預變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 30 s，退火58.5 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 50 s，循環(huán)30次；最后延伸72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 序列測定與分析

選擇擴增效果良好的PCR產物直接送蘇州金唯智生物科技有限公司進行純化后雙向測序。使用BioEdit[15]軟件、MEGA6[16]軟件對測序結果進行拼接，并篩選大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的SNP位點。

1.5 等位基因頻率估算

利用MWSnap的度量尺測量大通牦牛TLR2基因各SNP位點峰圖峰高，并估算各SNP位點等位基因頻率，公式如下：

其中，HBC為等位基因B或C在SNP位點中的等位基因頻率；B和C表示等位基因在SNP位點中的峰圖峰高[17]。

1.6 生物信息學分析軟件

大通牦牛TLR2基因mRNA二級結構使用在線程序RNA fold web server預測[18]；蛋白質二級結構預測網(wǎng)站為https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html[19]；蛋白質三級結構利用ExPASy的在線程序SWISS MODEL預測[20]。

2 結果與分析

2.1 大通牦牛TLR2基因PCR擴增結果

采用分段擴增方法，獲得包含大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的5段基因片段。PCR產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，引物特異性良好，PCR產物條帶單一。5段基因片段大小為522、822、574、526、599 bp，電泳結果與預期片段大小吻合(圖1)。

2.2 大通牦牛TLR2基因測序結果

利用MEGA6軟件、BioEdit軟件對測序結果進行拼接，并篩選SNP位點，結果表明，大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)存在2個SNP位點(G677A、G1587A)，其中G677A位點導致半胱氨酸(Cys)轉變?yōu)槔野彼?Tyr)，G1587A位點未發(fā)生氨基酸突變(圖2)。

2.3 SNP位點等位基因頻率估算

圖2 大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)測序峰圖及SNP位點Fig.2 Sequencing peak map and SNP locus of coding region of TLR2 gene in Datong yak

應用MWSnap軟件的度量尺對各SNP位點峰圖峰高進行測量，根據(jù)估算公式計算得G677A和G1587A位點等位基因頻率分別為G(0.606)、A(0.394)和G(0.829)、A(0.171)，結果表明，G677A位點和G1587A位點都以等位基因G為優(yōu)勢等位基因(表1)。

2.4 大通牦牛TLR2基因mRNA二級結構預測與分析

運用在線程序(RNA fold web server 服務器)預測參考序列(登錄號AF368419)和大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的兩個SNP位點(G677A、G1587A)mRNA二級結構(圖3)。對比參考序列mRNA二級結構，大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的兩個SNP位點均導致mRNA二級結構發(fā)生改變，進一步造成mRNA二級結構自由能發(fā)生變化。參考序列mRNA二級結構自由能為-679.3 kcal·mol-1，G677A位點和G1587A位點mRNA二級結構自由能均有所增加，依次為-679.10、-677.60 kcal·mol-1。

2.5 大通牦牛TLR2蛋白二級結構預測分析

大通牦牛TLR2基因G677A位點為錯義突變，突變前后蛋白質二級結構發(fā)生細微變化(圖4)。預測結果顯示，二級結構突變前：α-螺旋(h)占34.18%，β-折疊(e)占18.24%，無規(guī)則卷曲(c)占47.58%；二級結構突變后：α-螺旋(h)占35.71%，β-折疊(e)占16.84%，無規(guī)則卷曲(c)占47.45%。

2.6 大通牦牛TLR2蛋白三級結構預測分析

圖3 TLR2基因CDS區(qū)各SNP位點突變前后mRNA二級結構對比Fig.3 Contrast of secondary structure of TLR2 gene before and after mutation of SNP sites in coding region

運用在線程序SWISS MODEL進行同源建模預測蛋白三維結構。結果顯示，大通牦牛TLR2蛋白突變后三級結構發(fā)生細微變化，無規(guī)則卷曲和α-螺旋較多，與二級結構相符(圖5)。

h，α-螺旋；e，β-折疊；t，β-轉角；c，無規(guī)則卷曲。h， α-helix; e， β-folding; t， β-corner; c， Irregular crimping.圖4 大通牦牛TLR2蛋白突變前后二級結構對比Fig.4 Comparison of secondary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

圖5 大通牦牛TLR2蛋白突變前后三級結構對比Fig.5 Comparison of tertiary structure of TLR2 protein before and after mutation in Datong yak

3 討論

基因和環(huán)境的共同作用決定生物體的表型性狀，基因的多樣性決定生物體的基本免疫功能[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因作為固有免疫與適應性免疫之間的橋梁，在動物機體中占據(jù)著重要地位[23]。近年來，有關牛TLR2基因的研究主要集中在TLR2基因的結構和功能、多態(tài)性及其與疾病的相關性上。白杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在3個SNP位點。廖純穎[25]研究表明，奶牛不活躍的乳腺成纖維細胞同樣表達TLR2。林寶山等[26]利用熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中有高表達現(xiàn)象。TLR2蛋白還能識別并結合牛腸中的微小隱孢子蟲[27]。Lan等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TLR2基因在牦牛脾臟中同樣具有較高的表達。Yang等[29]研究表明，牛TLR2蛋白可通過NF-Κb途徑誘導白細胞介素-1β的產生。Zhao等[30]發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛TLR2基因存在2個SNP位點，并分析了其與結核病的相關性。

DNA混合池擴增后直接測序是一種簡單有效的SNP位點篩選方法[31]。單核苷酸多態(tài)性位點(single nucleotide polymorphism site，SNP)是指從基因組水平上對單個核苷酸突變位點進行研究和分析，對于研究基因的功能和指導抗病育種具有重要意義[32]。本研究采用DNA混合池擴增后直接測序的方法在大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)篩選到2個SNP位點(G677A、G1587A)，其中G677A位點為錯義突變，導致半胱氨酸(Cys)轉變?yōu)槔野彼?Tyr)，氨基酸的改變會導致TLR2蛋白的功能發(fā)生相應的變化。

CDS區(qū)核苷酸的改變可能會引起mRNA結構的改變，從而導致蛋白質的結構發(fā)生改變，進一步影響蛋白質的功能。大通牦牛TLR2基因mRNA二級結構預測結果顯示，兩個SNP位點mRNA二級結構均發(fā)生改變，自由能相比參考序列(登錄號AF368419)均有所增加，導致mRNA二級結構的穩(wěn)定性降低，可能會影響基因表達效率。大通牦牛TLR2蛋白二級結構中無規(guī)則卷曲占主導地位，G677A位點為錯義突變，導致α-螺旋由34.18%增加至35.71%，β-折疊由18.24%降低至16.84%，無規(guī)則卷曲由47.58%降低至47.45%。由于無規(guī)則卷曲是構成配體受體結合的活性部位，G677A突變可能會對蛋白質二級結構的穩(wěn)定性造成影響，從而影響蛋白質三級結構，使蛋白質功能發(fā)生變化。本研究對大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)的多態(tài)性進行了分析，檢測到一個錯義突變的SNP位點，可作為篩選大通牦牛疾病遺傳標記的理論基礎。