潘傳燕，林 勇，馮鵬霏，張永德，羅洪林

(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021)

熱休克同源蛋白Hsc70(heat shock cognate 70 ku protein)是熱休克蛋白Hsp 70家族(heat shock proteins， Hsp70)的成員之一，也稱Hsp73，是一種結(jié)合蛋白。Hsc70由兩個結(jié)構(gòu)域組成：一個結(jié)構(gòu)域(N端)是相對分子質(zhì)量為44 ku的三磷苷酶(ATPase)功能域，該區(qū)域高度保守，是ATP的結(jié)合位點；另一個結(jié)構(gòu)域(C端)是一個25 ku的區(qū)域，該區(qū)域包含3個部分：多肽結(jié)合功能域、靠近C末端的可變區(qū)和C末端的基序。Hsc70和Hsp70具有高度的序列同源性(95%)和相似的生物化學(xué)特性。Hsc70在所有正常細(xì)胞內(nèi)均能表達(dá)， 環(huán)境刺激(如細(xì)菌感染、高溫等)后其表達(dá)量有不同程度的增加[1-2]。Hsc70存在于原核及真核生物細(xì)胞中，具有多種生物學(xué)功能：作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、定位、組裝等[3]；參與免疫調(diào)節(jié)[4]；參與細(xì)胞的生命歷程，如細(xì)胞分裂、分化和凋亡[5-7]；參與細(xì)胞抗氧化，有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化及炎癥反應(yīng)帶來的傷害[8]等。此外，王宇萍[9]指出：Hsc70的表達(dá)水平與HBV的復(fù)制呈正相關(guān)，Hsc70可能成為抗HBV的新型藥物靶點。Hsc70 在不同組織中的表達(dá)量具有差異性，這一特點已經(jīng)在斑馬魚、鯉魚、黃顙魚和虹鱒等魚類中得到證實[2，10-12]。

羅非魚具有多種優(yōu)良的養(yǎng)殖性狀，受到世界各國養(yǎng)殖戶和消費者的青睞。我國是羅非魚養(yǎng)殖大國，但細(xì)菌性疾病的暴發(fā)給我國羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，并沖擊了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。羅非魚自身的抗應(yīng)激能力是抵御細(xì)菌感染、應(yīng)對環(huán)境脅迫的關(guān)鍵因素，決定了養(yǎng)殖成活率和養(yǎng)殖效益。Hsc70基因作為一種重要的看家基因，與生物體的抗逆抗應(yīng)激能力密切相關(guān)， 影響機體的存活能力和生長速率[5]。目前，部分魚類的Hsc70已被成功克隆，如黃顙魚、大菱鲆、南方鲇、虹鱒、青鳉、松江鱸、巖原鯉等。張娟等[2]發(fā)現(xiàn)黃顙魚Hsc70呈組成型表達(dá)，在多種組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有差異。高海霞[13]成功構(gòu)建了松江鱸Hsc70的原核表達(dá)載體，并獲得了其重組蛋白。研究表明，Hsc70受到高溫、重金屬、細(xì)菌感染等外界刺激時，會被誘導(dǎo)表達(dá)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14-15]。關(guān)于尼羅羅非魚Hsc70的原核表達(dá)和多抗制備還未見報道。因此，本研究利用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建尼羅羅非魚Hsc70表達(dá)載體，分析其重組蛋白的表達(dá)情況，制備多克隆抗體，以期為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚Hsc70的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

尼羅羅非魚cDNA、質(zhì)粒均為本實驗室制備；蛋白原核表達(dá)載體pET-B2m(由pET-28a改造而來)和轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌B21均為武漢金開瑞生物工程有限公司產(chǎn)品；T4 DNA Ligase、DNA聚合酶、蛋白marker、限制性內(nèi)切酶購自美國Fermentas公司；誘導(dǎo)劑IPTG購自德國默克公司，弗式完全佐劑、弗氏不完全佐劑是美國Sigma公司的產(chǎn)品；PVDF膜購自ThermoFisher公司；羊抗兔-HRP抗體購自美國Jackson公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；Ni-NTA親和層析樹脂購自GE Healthcare公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 抗原預(yù)測

采用在線分析工具ExPASy中的ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測Hsc70蛋白質(zhì)疏水性，TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測Hsc70蛋白序列的跨膜區(qū)間。使用DNAstar軟件預(yù)測Hsc70蛋白的親水性、抗原指數(shù)等。采用Swiss-model在線分析軟件(https：//swissmodel.expasy.org)對Hsc70蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)建模。

1.2.2Hsc70基因擴增與原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)尼羅羅非魚Hsc70基因序列(NCBI登錄號：XP 003455104.1)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物序列為5′-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGAGCAAAGGTCCGG-3′；下游引物序列為5′-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACATCAACTTCTTCAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 45 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共28個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后進(jìn)行切膠回收。

將PCR產(chǎn)物和載體用SalⅠ與BamHⅠ進(jìn)行雙酶切處理后，將目的片段與載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-B2m-Hsc70，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌B21；篩選含有Amp+的陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.2.3 重組蛋白的原核表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒(pET-B2m-Hsc70)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株B21，在含有Amp+(100 g·mL-1)的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600為0.6，之后培養(yǎng)溫度降至30 ℃；加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。收集菌液，6 000g離心10 min收集菌體。用冰浴超聲波破碎細(xì)菌，在4 ℃的低溫條件下20 000g離心30 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)情況和可溶性。

在Ni-NTA樹脂層析柱中緩慢加入收集的誘導(dǎo)表達(dá)菌，流速為0.5 mL·min-1，收集穿柱液體。層析用 10倍柱床體積的NTA-0緩沖液沖洗，流速控制在1 mL·min-1左右，接著分別用10倍柱床體積的NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500緩沖液洗脫，控制流速約1 mL·min-1，收集各洗脫液，通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的純度，紫外吸收法檢測純化蛋白的濃度。純度達(dá)到要求的組分，于透析袋中4 ℃以1×PBS進(jìn)行透析，最后于4 ℃超濾濃縮透析產(chǎn)物，用5 mL 8 mol·L-1的尿素溶液溶解目的蛋白。

1.2.4 多克隆抗體制備、效價檢測

取2只日本大耳兔，耳靜脈采血作為免疫前血清。純化后的重組蛋白與等容積的弗氏完全佐劑混合，采用皮下多點注射法按每只500 μg的劑量免疫2只日本大耳白兔。每只兔子至少經(jīng)過4次免疫，根據(jù)免疫效價，評估是否進(jìn)行第5次、第6次的免疫，每次免疫中間隔14 d。免疫7 d后，耳靜脈采血，用間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。

重組Hsc70蛋白(2 μg·mL-1)按每孔100 μL的量加入96孔板中進(jìn)行抗原包被，4 ℃過夜；將待檢血清按1∶2 000、1∶4 000作二倍梯度稀釋至1∶32 768 000，稀釋液作為一抗，各稀釋梯度取100 μL至96孔板中，以免疫前血清作為陰性對照；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗。每個反應(yīng)孔用TMB顯色液100 μL顯色20 min，之后加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測450 nm處的D值。出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最大稀釋度即是待測樣品的效價。

1.2.5 抗體純化

采用Protein G親和層析柱對Hsc70蛋白多克隆抗體進(jìn)行純化，詳細(xì)操作步驟見張永德等[16]，將抗血清與2×PBS緩沖液等體積混合，經(jīng)10倍柱體積以上的PBS洗滌，至流出液無蛋白檢出，加入2倍柱體積0.1 mol·L-1檸檬酸(pH 2.7)洗脫，收集洗脫產(chǎn)物，純化所得的抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Western blot檢測

取25 ng和10 ng純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于封閉液中封閉2 h。加入制備的多克隆抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h；洗滌后再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h后進(jìn)行顯色反應(yīng)，取出拍照分析抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原分析結(jié)果

根據(jù)蛋白的二級機構(gòu)、B細(xì)胞表位、跨膜序列、疏水性等參數(shù)的分析(圖1)，Swiss-model構(gòu)建的Hsc70 3D模型見圖2。結(jié)果顯示，Hsc70基因編碼蛋白由646個氨基酸組成，從重組蛋白表達(dá)來看，無跨膜區(qū)，無信號肽序列，親水性好，抗原指數(shù)得分也適中，可以引起較好的免疫。

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

以重組質(zhì)粒pET-B2m-Hsc70為模板，擴增Hsc70基因，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條1 938 bp的目的條帶(圖3)，與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果顯示：連接到載體中的目的序列與NCBI上的序列一致，且方向正確，確定Hsc70基因已正確插入載體pET-B2m中，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 目的蛋白的表達(dá)與鑒定結(jié)果

對重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)條件為：

圖1 尼羅羅非魚Hsc70抗原表位分析Fig.1 Analysis of epitope of Hsc70 in Nile tilapia

圖2 Hsc70三級結(jié)構(gòu)建模Fig.2 Hsc70 tertiary structure modeling

M，DL2000；1，Hsc70。圖3 Hsc70基因擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of Hsc70

M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1～2，其他蛋白；3，表達(dá)菌上清；4，表達(dá)菌沉淀。M， Marker；1～2， Other proteins; 3， The supernatant of expressed proteins；4， The precipitate of expressed proteins.圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4，上清液與沉淀均在75 ku處出現(xiàn)蛋白條帶，且沉淀的蛋白條帶較上清液粗，沉淀中的目的蛋白含量顯著高于上清液(圖4)，說明重組蛋白主要存在于沉淀中，目的蛋白主要以包涵體的形式存在。

2.4 重組蛋白純化結(jié)果

重組Hsc70蛋白主要以包涵體的形式存在，利用Ni-NTA樹脂層析柱純化目的蛋白。純化后的重組蛋白經(jīng)10倍稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，在75 ku處有一條清晰的條帶(圖5)。純化后重組蛋白的純度達(dá)到90%，濃度為2 mg·mL-1，是適合免疫日本大耳兔的抗原。

M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1，Hsc70。M， Marker；1， Hsc70.圖5 重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

2.5 多克隆抗體的效價測定

以免疫前血清作為陰性對照，免疫7 d后，耳靜脈采血，用間接ELISA法檢測多克隆抗體的效價。結(jié)果如圖6，抗體的效價為 1∶2 048 000，說明該重組蛋白能誘導(dǎo)日本大耳兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。

圖6 Hsc70多克隆抗體的ELISA曲線Fig.6 ELISA curves of Hsc70 polyclonal antibody

2.6 抗體純化結(jié)果

收集的抗血清經(jīng)Protein G親和層析柱純化后，通過SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，在約50 ku和25 ku處均出現(xiàn)一條清晰的蛋白條帶(圖7)。純化后的抗體純度大于85%，濃度為10 mg·mL-1，抗體純化效果良好。

2.7 Western blot檢測結(jié)果

純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果見圖8，25 ng和10 ng重組蛋白均在約75 ku處出現(xiàn)一條清晰蛋白條帶，且25 ng蛋白條帶較10 ng的蛋白條帶粗，而免疫前血清對照組在相應(yīng)位置無特異性條帶，不存在特異性反應(yīng)，表明Hsc70抗血清具有較高的特異性。

M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1，Hsc70抗體。M， Marker; 1， Hsc70 polyclonal antibody.圖7 Hsc70抗體純化結(jié)果Fig.7 Analysis of purified products of Hsc70 polyclonal antibody

M，蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1，10 ng Hsc70重組蛋白；2，25 ng Hsc70重組蛋白；3，陰性對照。M， Marker; 1， 10 ng Hsc70 recombinant protein; 2， 25 ng Hsc70 recombinant protein; 3， Negative control.圖8 Western blot印跡分析多克隆抗體的特異性Fig.8 Specificity of polyclonal antibody by Western blot assays

3 討論

Hsp70是熱休克蛋白中最保守、最重要，也是研究最深入的蛋白質(zhì)家族之一，能在各種外界刺激如溫度脅迫、鹽度脅迫、溶解氧脅迫、微生物感染等的誘導(dǎo)下表達(dá)。Hsc70是Hsp70家族的結(jié)構(gòu)型蛋白成員之一，含有較多的內(nèi)含子，具有管家基因的功能，研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠體內(nèi)的Hsc70基因，小鼠細(xì)胞無法存活[17]。在正常環(huán)境下，Hsc70為組成型表達(dá)[18]，受到外界刺激時為誘導(dǎo)表達(dá)，這一點已在部分魚類得到驗證，如病原感染能誘導(dǎo)大菱鲆Hsc70表達(dá)[19]，熱刺激可誘導(dǎo)黃顙魚Hsc70表達(dá)[2]。目前，已在多種生物中克隆出Hsc70，如近江牡蠣、草魚、孔雀魚、豆卜饃夜蛾、中華鱉、凡納濱對蝦等[4，20-24]。鄭薇薇[25]首次克隆了棉鈴蟲Hsc70，并證實20-羥基蛻皮酮可誘導(dǎo)Hsc70入核表達(dá)。馮冰冰等[26]從縊蟶中獲得了Hsc70亞家族基因并命名為ScHsc70，ScHsc70基因可能參與了對細(xì)菌感染的防御反應(yīng)。章海濱等[5]克隆出巖原鯉Hsc70，其氨基酸序列與草魚的有100%同源性，巖原鯉Hsc70基因的表達(dá)存在明顯的組織差異性。Li等[27]報道，中國軟殼海龜受熱刺激后，Hsc70轉(zhuǎn)錄水平會迅速上調(diào)，其蛋白相對表達(dá)量增加數(shù)十倍。

多克隆抗體是用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物，該動物機體所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體，所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物。制備多克隆抗體過程較簡單，直接用抗原免疫動物，經(jīng)過3～4次免疫，ELISA檢測效價，收集抗血清，純化后即可得到多克隆抗體。制備高效價的抗體是檢測基因表達(dá)和研究基因功能的重要前提[28]。多克隆抗體具有制備周期短、技術(shù)要求不高、穩(wěn)定性較好、能識別多個表位、制備成本較低等優(yōu)點，廣泛使用于多個科研領(lǐng)域[29]，如常用于變性蛋白的檢測，石蠟包埋組織切片的染色，相應(yīng)抗原的標(biāo)記，農(nóng)藥殘留現(xiàn)場監(jiān)測，病原物的檢測、疾病的診斷及治療等。多克隆抗體因制備較簡單和用途廣泛而在細(xì)菌、病毒、動植物等多種生物開展研究，通過制備多克隆抗體為進(jìn)一步研究相關(guān)蛋白的功能做準(zhǔn)備。洪偉鳴等[30]制備了單增李斯特菌溶血素(listeriolysiono，LLO)多克隆抗體；畢莊莉等[31]獲得了效價高、特異性好的新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白的多克隆抗體；彭琪琪等[32]制備了一個植物半胱氨酸蛋白酶的多克隆抗體等。本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)尼羅羅非魚Hsc70蛋白，通過純化包涵體蛋白并免疫日本大耳兔獲得了效價高、特異性強的多克隆抗體。

在制備抗體前對目的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有利于提高抗體制備的成功率。Hsc70基因結(jié)構(gòu)上高度保守，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析，編碼646個氨基酸，無跨膜區(qū)，無信號肽序列，親水性好，抗原表位較好，適合用于抗原抗體制備。本研究在對Hsc70進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，表達(dá)全長蛋白進(jìn)行多抗免疫，實驗結(jié)果表明，全長表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，獲得的多克隆抗體，效價達(dá)1∶2 048 000，且能特異性的識別尼羅羅非魚Hsc70蛋白。本研究獲得的重組蛋白和多克隆抗體為Hsc70功能研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。