馬 杰，鄭 好，周 平，陳春艷，吳 瑞，馬 維，宋 雷，孫 勃，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學研究所，貴州 畢節(jié) 551700)

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是茄科茄屬一年生草本植物[1]，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，自17世紀傳入我國后，就已成為我國傳統(tǒng)的、主要的糧食作物之一，也是重要的蔬菜、飼料和工業(yè)原料，以及多用途的高產(chǎn)、高適應(yīng)性農(nóng)作物[2]。馬鈴薯具有效益高、耐瘠薄、產(chǎn)業(yè)鏈長、易于加工、營養(yǎng)價值高等優(yōu)勢[3]。油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)是廣泛存在于植物中的相似于動物甾醇類激素的一種天然產(chǎn)物[4]。大量植物生理與分子生物學研究結(jié)果表明，油菜素內(nèi)酯在植物的正常生長發(fā)育過程中是不可缺少的[5]，許多植物生理學家已將其列為植物的第6大類激素。BR普遍存在于植物中，在植物的不同器官，如根、莖、葉、花粉、雌蕊、果實和種子中均有分布[6]。BR參與調(diào)控植物生長發(fā)育、植物與環(huán)境間的相互作用，并能增加作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)和增強作物抗逆性[7]，還能夠提高作物的抗冷性[8]、抗熱性[9]、抗旱性[10]等。BR之所以具有這些功能，可能是因為BR可以激活植物中的氧化酶保護系統(tǒng)，從而盡快消除植物體內(nèi)由于逆境而產(chǎn)生的過多有害自由基，提高植物抵抗逆境的能力[11]，以此增強植物抗性。擬南芥中存在12種BSK蛋白激酶，這12種都屬于受體細胞質(zhì)蛋白激酶第12家族(RLCK-XII)。BSK1是BR信號通路中的一個重要的信號轉(zhuǎn)導激酶，它與定位在膜上的BRI1結(jié)合并在BR誘導下，作為BRI1的底物被激活，從而將BR信號傳導到下游，介導BR誘導的抗氧化防護酶活性的增強[4]。

目前，關(guān)于BR信號轉(zhuǎn)導途徑的研究大都僅限于擬南芥信號轉(zhuǎn)導途徑組分的同源基因克隆和相應(yīng)突變體的分析[12]，BSK基因在擬南芥[13]、水稻[14]、玉米[4]等中有部分研究，但在馬鈴薯中的研究尚未見報道。本試驗克隆了馬鈴薯StBSK基因家族的7個成員，為進一步研究馬鈴薯StBSK基因的調(diào)控功能奠定了分子基礎(chǔ)，也為明確StBSK基因在增加馬鈴薯植株的脅迫耐受能力中的作用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以馬鈴薯栽培品種宣薯2號為材料，2017年9月將其原原種塊莖播種于花盆中，定期進行水肥管理，21 d后剪取馬鈴薯植株幼苗的3～5片真葉，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA提取。

1.2 試驗試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2 000 DNA marker購于大連寶生物公司，TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase聚合酶、Trans1-T1克隆感受態(tài)細胞、克隆載體pEASY-Blunt等購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，氨芐青霉素(Amp)、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒等購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA合成

采用改良的CTAB法[15]提取馬鈴薯的RNA，電泳檢測RNA的完整性，并利用核酸蛋白儀測定RNA的濃度和純度(D260/D280=1.8～2.0為宜)。選取質(zhì)量較好的RNA依據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA模板，所得產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.4 基因克隆

根據(jù)NCBI已公開的擬南芥等BSK基因序列，設(shè)計馬鈴薯BSKs基因特異性引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(40 μL)：pfuFly聚合酶0.8 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.6 μL，cDNA模板1.6 μL，Buffer 8 μL，dNTPs(2.5 mmol·L-1)3.2 μL，ddH2O 23.2 μL。其中，StBSK1、StBSK4、StBSK6、StBSK7的反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，53 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。StBSK2、StBSK3、StBSK5的反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，40個循環(huán)；72 ℃，10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物。將產(chǎn)物連接至平末端pEASY-Blunt克隆載體上，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Trans1-T1感受態(tài)細胞中，涂布于含IPTG、Amp和X-gal的LB平板上，倒置于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～12 h，待長出明顯而又未相互重疊的單菌落時，將平板放置于4 ℃數(shù)小時至顯色完全。挑取10個生長狀態(tài)良好的白色單菌落于1 mL LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。以菌液為模板進行PCR擴增，將電泳檢測條帶長度為1 500 bp左右的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 馬鈴薯StBSKs基因克隆引物

Table 1 The cloning primer ofStBSKsinSolanumtuberosum

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence (5’-3’)StBSK1-FGGGTTATCATGGGTTGTTGTCAATCTTCStBSK1-RAGGGTATTATCAAGATGCACGTCCAStBSK2-FAGCTGATGAAAAATGGGCTGTTTACAGStBSK2-RCCAGAATCAGTTACGCCAACTGTTTAACStBSK3-FGGGGTAATAGGATGGGCTGTGAGStBSK3-RTCGCCACTTTCAGGAATTTGTGTTCStBSK4-FGTTGGATAGTGTGATGGGCTGTGAAAStBSK4-RGCCACTTTCAAGAAGATGTGTTTTTCTCStBSK5-FTGCTCTGAAATGGGTGGTCGTTCStBSK5-RTTAATTTTTGCTCCTTTTGCCTTCCAACTStBSK6-FTGTTTTCATTTTCACTGTCAAATGGGTGCStBSK6-RAATGCAAATCTATACAGTTTCAGTTTTTGTStBSK7-FATGGGTGGTCGTTGTTCCAATTTATGStBSK7-RTTATTGTCTCATTCTTCTGAAGTCCAAGG

1.5 生物信息學分析

利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件預(yù)測StBSKs基因的相對分子質(zhì)量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)；由TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件分析和推測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；通過WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)軟件進行亞細胞定位預(yù)測；使用NCBI-BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)結(jié)合DNAMAN 6.0軟件進行同源序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析；用MEGA 6.0軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StBSKs基因的克隆

經(jīng)電泳檢測可明顯地觀察到28S和18S條帶，且28S條帶的亮度在18S條帶亮度的2倍以上(圖1)，D260/D280比值為1.9，表明馬鈴薯總RNA質(zhì)量合格，可用于后續(xù)克隆試驗。將StBSKs基因的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，分別得到7個長度約為1 500 bp的特異性條帶(圖2)，這些條帶大小與預(yù)測片段一致。陽性克隆測序得到7條長度分別為1 497、1 479、1 464、1 461、1 476、1 476和1 476 bp的序列，并將其分別命名為StBSK1、StBSK2、StBSK3、StBSK4、StBSK5、StBSK6和StBSK7。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 StBSKs蛋白理化性質(zhì)分析和亞細胞定位預(yù)測

馬鈴薯StBSKs基因所編碼的氨基酸序列的理化分析結(jié)果如表2所示。不穩(wěn)定指數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白，大于40為不穩(wěn)定蛋白，由此可知，StBSK1、StBSK3、StBSK4和StBSK5為不穩(wěn)定蛋白，而StBSK2、StBSK6和StBSK7為穩(wěn)定蛋白。平均疏水指數(shù)均為負值，表明其均為親水性蛋白。StBSKs蛋白的氨基酸組成具體見表3；SignalP、TMHMM等軟件分析發(fā)現(xiàn)，StBSKs蛋白均不存在信號肽結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域，均為非分泌蛋白或膜外蛋白。亞細胞定位表明，StBSK1主要位于細胞核，StBSK2、StBSK3、StBSK4主要位于細胞質(zhì)，StBSK5、StBSK7主要位于葉綠體，StBSK6主要位于線粒體。

圖1 馬鈴薯總RNAFig.1 Total RNA extracted from Solanum tuberosum

M， DL 2 000 marker; 1， StBSK1; 2， StBSK2; 3， StBSK3; 4， StBSK4; 5， StBSK5; 6， StBSK6; 7， StBSK7。圖2 馬鈴薯StBSKs基因PCR擴增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification products of StBSKs in Solanum tuberosum

表2 馬鈴薯StBSKs基因家族生物信息學分析結(jié)果

Table 2 Bioinformatics analysis ofStBSKsgene family inSolanumtuberosum

基因Genes長度Length/bp氨基酸數(shù)Aminoacidnumber理論分子量Calculatedmolecularmass/ku理論等電點Isoelectricpoint(pI)總原子個數(shù)Totalnumberof atoms不穩(wěn)定指數(shù)Instabilityindex脂肪指數(shù)Liposolubleindex平均疏水指數(shù)Averagehydrophobicindex亞細胞定位Subcellularlocalization轉(zhuǎn)運肽長度Transitpeptidelength分子式MolecularformulaStBSK1149749855648.005.77771541.7075.06-0.421細胞核Nucleus32C2435H3815N685O750S30StBSK2147949255242.975.83773439.2583.29-0.378細胞質(zhì)Cytoplasm4C2441H3856N672O741S24StBSK3146448754732.225.64763146.5781.17-0.407細胞質(zhì)Cytoplasm21C2399H3794N676O735S27StBSK4146148654237.635.14756444.7483.17-0.288細胞質(zhì)Cytoplasm4C2391H3760N650O737S26StBSK5147649154930.435.90762544.1777.15-0.336葉綠體Chloroplast39C2410H3776N674O734S31StBSK6147649155245.086.05769636.9179.33-0.326線粒體Mitochondria4C2452H3818N670O727S29StBSK7147649155306.886.37770737.2080.10-0.381葉綠體Chloroplast25C2444H3824N674O739S26

表3 馬鈴薯StBSKs氨基酸組成比例

Table 3 Proportions of amino acid composition of StBSKs inSolanumtuberosum

%

2.2.2 馬鈴薯StBSKs蛋白結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列

保守結(jié)構(gòu)域和序列比對結(jié)果表明，StBSKs蛋白為RLCK-Ⅻ類超家族，均含有典型的N端激酶結(jié)構(gòu)域PKc(putative kinase catalytic)、C端三羧氨酸重復TPR(tetratricopeptide repeats)結(jié)構(gòu)域，StBSKs成員間N端存在較大差異。7個StBSKs蛋白成員間的氨基酸序列相似性達到75.89%，成員間兩兩互相比對，相似性在55.49%～87.27%，其中，StBSK3和StBSK4氨基酸序列的相似性最高(87.27%)(圖3)。

2.2.3 馬鈴薯StBSKs蛋白系統(tǒng)進化樹

StBSKs的氨基酸序列與辣椒(Capsicumannuum)、芝麻(Sesamumindicum)、中?？Х?Coffeacanephora)、黃燈籠辣椒(Capsicumchinense)、漿果狀辣椒(Capsicumbaccatum)、木犀欖(Oleaeuropaeavar.Sylvestris)、番茄(Solanumlycopersicum)等多種植物的BSK蛋白氨基酸序列一致性高達90%以上，與中華獼猴桃(Actinidiachinensisvar.Chinensis)、木薯(Manihotesculenta)、毛果楊(Populustrichocarpa)等植物的BSK氨基酸一致性達80%以上。13種不同植物與馬鈴薯StBSKs蛋白的系統(tǒng)進化樹分析結(jié)果表明，StBSKs大致可分為2大分支，馬鈴薯StBSK1、StBSK2被聚在第一大分支，其中，StBSK1、StBSK2分別與同為茄科的辣椒、野生煙草(Nicotianaattenuata)聚在2個小分支，這一分支還包括了同為大戟科的木薯(Manihotesculenta)和橡膠樹(Heveabrasiliensis)；馬鈴薯StBSK3和StBSK4與同為茄科的黃燈籠辣椒聚在一個小分支，StBSK5和StBSK6與同為茄科的漿果狀辣椒聚在一個小分支，StBSK7與同為茄科的番茄聚在一個小分支，他們共同聚在第二大分支。表明，同科物種間的BSK親緣關(guān)系更近，其中，StBSK3和StBSK4、StBSK5和StBSK6關(guān)系最近(圖4)。

3 結(jié)論與討論

油菜素內(nèi)酯是一種類似動物甾醇類激素的植物激素，廣泛存在于各種植物的不同器官，具有調(diào)控植物生長發(fā)育、增強作物抗逆性的生物學功能。在BR的信號通路中，BSK是一個重要的信號轉(zhuǎn)導激酶，將BR信號傳導到下游。本試驗首次分離了馬鈴薯StBSK基因家族的7個成員。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，7個馬鈴薯StBSK成員均與茄科的物種聚為同支，說明BSK在進化過程中與同科物種間的親緣關(guān)系較近。StBSKs基因含有典型的保守結(jié)構(gòu)域PKc、三羧氨酸重復結(jié)構(gòu)域，PKc位點在氨基酸序列73～307，三羧氨酸重復結(jié)構(gòu)域位點在390～489，這2個保守域分別在細胞分裂、增殖、凋亡、分化過程中發(fā)揮作用，還能介導蛋白與蛋白間的互作[18]。7個馬鈴薯StBSKs氨基酸序列存在一定差異性，且N端保守性較差。StBSKs氨基酸序列富含絲氨酸和蘇氨酸，含少量的酸性氨基酸，這與轉(zhuǎn)運肽的性質(zhì)相符。亞細胞定位分析表明，這些馬鈴薯StBSKs蛋白可能主要位于細胞質(zhì)、細胞核、葉綠體和線粒體，因此推測這些StBSKs蛋白的轉(zhuǎn)運肽類型可能不同。

圖3 馬鈴薯StBSKs氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of deduced amino acid sequences of StBSKs in Solanum tuberosum

圖4 馬鈴薯和其他植物的StBSKs蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of StBSKs in Solanum tuberosum and other plants

BSK基因家族成員在不同植物中的數(shù)目和功能存在異同。擬南芥中有12個BSK基因，玉米中有14個BSK基因，玉米中ZmBSK1蛋白可能在質(zhì)膜系統(tǒng)中起感應(yīng)與傳導信號的作用；ZmBSK5可能與AtBSK3、AtBSK4、AtBSK6、AtBSK7、AtBSK8功能相似，能夠引起植物表型變化；ZmBSK9可能與AtBSK1作用相同，均能結(jié)合受體BRI1，調(diào)節(jié)玉米的BR信號轉(zhuǎn)導途徑等；ZmBSK2.1與AtBSK1同源，其可能參與免疫反應(yīng)(PAMP-triggered Immunity， PTI)的調(diào)節(jié)[19]。綜上，推測StBSKs基因在馬鈴薯生長發(fā)育過程與抗逆境脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用，還參與BR信號的感應(yīng)和傳導作用。