王 瑩，王彥會(huì)，劉月平，姜 琳

(吉林省肝膽病醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130051)

紫杉醇(PTX)可以作用于細(xì)胞分裂過(guò)程中組成紡錘體的微管蛋白的特定部位從而起到防止其解聚的作用，在細(xì)胞分裂過(guò)程中，不能由微管蛋白迅速合成紡錘體微管，使細(xì)胞的分裂永遠(yuǎn)停留在G2和M期，導(dǎo)致其無(wú)法復(fù)制，從而起到殺死癌細(xì)胞的作用[1-5]。而PTX的溶解性問(wèn)題是其制劑的首要問(wèn)題[6]。另外，PTX作為細(xì)胞毒性的抗腫瘤藥物，因?yàn)槿狈δ[瘤靶向性，甚至導(dǎo)致全身性毒性[7]，特別是中性粒細(xì)胞減少癥等免疫性疾病，這使得其臨床應(yīng)用受到很大限制。我們?cè)谇捌谘芯恐幸阎苽涑鲆跃埘０肪酆衔?(PAMAM)-聚乙二醇(PEG)為骨架的葉酸(FA)/透明質(zhì)酸(HA)雙靶向載PTX膠束，載藥量為18.5%，本研究利用此類自制的膠束，考察其在小鼠的瘤內(nèi)分布及抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 十八胺、N,N一二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N一二環(huán)己基碳二亞胺、FA、HA、1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺均購(gòu)自麥克林；硼酸購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；十水合四硼酸鈉、二甲亞砜均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NH2-PEG2000-COOH、透析袋均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PAMAM購(gòu)自威海晨源分子新材料有限公司。SKOV-3 細(xì)胞株及B16細(xì)胞株購(gòu)自南昌樂(lè)悠生物科技有限公司；PTX購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 H-J磁力加熱攪拌器(鞏義市裕華儀器有限責(zé)任公司)，PH400基礎(chǔ)型酸度計(jì)(安萊利斯有限公司)，TY96-11IV超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新藝生物科技葛粉有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(Thermo)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅有限公司)，GOLD-SIM冷凍干燥機(jī)(美國(guó)金西盟國(guó)際集團(tuán))，小動(dòng)物活體成像儀capliper(lumina series)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1熒光標(biāo)記的載PTX膠束的制備 利用PAMAM的氨基末端與異硫氰酸熒光素的異硫氰基可以共價(jià)結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)，制備熒光標(biāo)記物。稱取PAMAM適量，溶于PBS緩沖液中(pH=7.4)，緩慢滴加異硫氰酸熒光素的丙酮溶液。摩爾比為PAMAM:異硫氰酸熒光素=1∶1.2。避光磁力攪拌36 h，透析袋中透析3 d，離心除去未反應(yīng)的異硫氰酸熒光素，凍干得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記的PAMAN聚合物。異硫氰酸熒光素，在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，顯示特征綠色熒光。稱取硼砂1.8953 g、硼酸 1.2357 g 溶于1 L蒸餾水中，得到pH=8的緩沖溶液，避光保存。將PAMAM 2.0796 g和PEG 0.1410 g溶于20 mL硼砂-硼酸緩沖液中，室溫，避光，磁力攪拌12 h。將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至50 Kd截留分子量的超濾管中超濾，轉(zhuǎn)速為4000 rpm/min，30 min/次，共超濾7次，收集上層液體，凍干后稱重、密封保存。按參考文獻(xiàn)的方法合成HA-C18[8]，并進(jìn)一步合成FA-HA-C18[9]，凍干后稱重、密封保存。稱取PTX 50 mg，溶于2.5 ml無(wú)水乙醇中，用無(wú)水乙醇溶解的PTX緩慢滴加至FA-HA-C18的溶液中，磁力攪拌24 h，冰浴超聲10 min，溶液于4000 rpm/min離心30 min，上清液經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜，得到FA-HA-PTX混合物。在上述混合液中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應(yīng)12 h，加至PEG-PAMAM的水溶液中。用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至8.0，室溫避光反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水透析，離心除雜質(zhì)，凍干后稱重、密封保存。

1.2.2建立SKOV-3荷瘤裸鼠模型及小動(dòng)物活體成像檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞5×106個(gè)，接種至5-6周的雌性荷瘤裸鼠的右側(cè)腋下，待腫瘤體積長(zhǎng)至1 cm3時(shí)分為三組，經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行給藥，第一組為對(duì)照組，給予生理鹽水溶液，第二組為給藥組，給予熒光標(biāo)記的載PTX膠束(紫杉醇3 mg/kg)。分別于注射后0.5 h，2 h，6 h，12 h，24 h乙醚麻醉小鼠，進(jìn)行小動(dòng)物活體熒光成像實(shí)驗(yàn)，記錄腫瘤部位的熒光強(qiáng)度。小動(dòng)物活體成像儀測(cè)定載PTX膠束的熒光(綠光)。

1.2.3建立B16荷瘤小鼠模型及抑瘤率、生存情況的評(píng)價(jià) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞1×106個(gè)，接種至6-8周的雄性C57BL/6小鼠的右側(cè)腋下，待腫瘤體積長(zhǎng)至1 cm3時(shí)分為三組，經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行給藥，第一組為對(duì)照組，給予生理鹽水溶液，第二組為陽(yáng)性組，給予小分子PTX 3 mg/kg，第三組為給藥組，給予載PTX膠束(紫杉醇3 mg/kg)，分別于接種后1 d、7 d、14 d和21 d經(jīng)尾靜脈注射，每天觀察小鼠的生存狀況，并隔天記錄腫瘤大小，按如下公式計(jì)算腫瘤體積、抑瘤率、繪制生存曲線，計(jì)算平均生存時(shí)間和生存延長(zhǎng)期。腫瘤體積：V=a×b2/2(a 長(zhǎng)徑，b 短徑)。抑瘤率(%)=(1-D/S)×100 (D，治療組腫瘤體積；S，生理鹽水組腫瘤體積)。生存期延長(zhǎng)率(%)=(T/C-1)×100(T，治療組的平均生存時(shí)間，C，對(duì)照組的平均生存時(shí)間)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤的熒光成像

如圖1所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光標(biāo)記載PTX膠束的腫瘤部位熒光蓄積逐漸增多，均顯著高于對(duì)照組，尤其在12 h時(shí)及24 h時(shí)最多，說(shuō)明熒光標(biāo)記載PTX膠束的腫瘤靶向性較好。

圖1 腫瘤內(nèi)熒光成像(對(duì)照組：給予生理鹽水溶液；給藥組：給予熒光標(biāo)記的載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

2.2 腫瘤的抑瘤效果及小鼠生長(zhǎng)情況

如圖2所示，載PTX膠束(給藥組)的抑瘤效果與小分子PTX(陽(yáng)性組)類似，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，給藥組和陽(yáng)性組腫瘤的體積逐漸降低，從接種20 d開始，給藥組腫瘤體積較陽(yáng)性組略有降低，說(shuō)明載PTX膠束的抑瘤效果明顯，且略強(qiáng)于小分子PTX。

圖2 各組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況(對(duì)照組：給予生理鹽水溶液；陽(yáng)性組：給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組：給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

如圖3所示，載PTX膠束組小鼠的平均生存時(shí)間隨著時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，陽(yáng)性組和對(duì)照組小鼠的平均生存時(shí)間逐漸降低，陽(yáng)性組小鼠的平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，說(shuō)明載PTX膠束組小鼠的平均生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組和小分子PTX組。

圖3 各組小鼠的平均生存時(shí)間(對(duì)照組：給予生理鹽水溶液；陽(yáng)性組：給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組：給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg)

如表1所示，載PTX膠束組小鼠的抑瘤率顯著強(qiáng)于對(duì)照組，略強(qiáng)于陽(yáng)性組；載PTX膠束組小鼠的平均生存時(shí)間顯著長(zhǎng)于對(duì)照組及陽(yáng)性組；載PTX膠束組小鼠的生長(zhǎng)期延長(zhǎng)率顯著高于對(duì)照組及陽(yáng)性組。

表1 各組小鼠的抑瘤率、平均生長(zhǎng)時(shí)間及生長(zhǎng)期延長(zhǎng)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：對(duì)照組給予生理鹽水溶液；陽(yáng)性組給予小分子PTX 3 mg/kg，給藥組給予載PTX膠束，含紫杉醇3 mg/kg。

3 討論

惡性腫瘤已經(jīng)成為影響人類健康的主要疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2010年有超過(guò)1200萬(wàn)人被確診患上癌癥，有760萬(wàn)病人死于各種癌癥。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，惡性腫瘤的死亡率居城市和農(nóng)村全部死亡病例之首，并有明顯上升趨勢(shì)。如今，惡性腫瘤的治療方法中，化療是主要方法之一[10-13]，但化療藥物又存在缺乏靶向性和毒副作用大的缺陷。所以設(shè)計(jì)構(gòu)建毒副作用小，靶向性高的抗腫瘤靶向載體系統(tǒng)具有很好的藥學(xué)研究前景。

分子物質(zhì)和脂質(zhì)在腫瘤組織透過(guò)性增強(qiáng)及滯留效應(yīng)稱作實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)[14,15]，EPR效應(yīng)促進(jìn)了大分子類物質(zhì)在腫瘤組織的選擇性分布,可以增加藥效并減少系統(tǒng)副作用，本研究基于EPR效應(yīng)原理，將高分子聚合物與小分子化療藥物的偶聯(lián)物，通過(guò)藥劑學(xué)手段結(jié)合到高分子材料表面，有效地緩解了傳統(tǒng)納米粒的突釋效應(yīng)，因而具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。并且通過(guò)雙靶向載藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)進(jìn)一步提高PTX抗腫瘤作用，并改善其毒副作用。本研究中采用了FA和HA作為腫瘤靶向基團(tuán)，對(duì)PTX-PAMAM進(jìn)行了雙靶向的修飾，并組裝成膠束進(jìn)行了體內(nèi)評(píng)價(jià)。

體內(nèi)評(píng)價(jià)首先采用了半定量的小動(dòng)物活體成像實(shí)驗(yàn)，初步考察了載PTX膠束在SKOV-3荷瘤裸鼠腫瘤部位的蓄積，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光標(biāo)記載PTX膠束的腫瘤部位熒光蓄積逐漸增多，均顯著高于對(duì)照組，尤其在12 h時(shí)及24 h時(shí)最多，說(shuō)明熒光標(biāo)記載PTX膠束的腫瘤靶向性較好。其次，采用B16荷瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤活性研究，通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)曲線、小鼠生存曲線及抑瘤率等觀察，均可看出載PTX膠束組在小鼠的抑瘤率、生存時(shí)間、生存率等方面均顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。由此可見，將高分子聚合物與小分子化療藥物PTX偶聯(lián)，并以雙主動(dòng)靶向基團(tuán)修飾載體后組裝成納米膠束，在體內(nèi)抑瘤效果及腫瘤靶向標(biāo)記等方面均是一種可行的途徑，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。