孫艷麗,陳 武,陳 飛

(吉林省腫瘤醫(yī)院 1.內(nèi)二科；2.核醫(yī)學(xué)科,吉林 長春130012)

結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，手術(shù)、放療、化療、分子靶向治療，使結(jié)直腸癌患者的預(yù)后有所改善，但仍有轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)。近年來靶向腫瘤微環(huán)境成為腫瘤治療的新途徑。叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)是叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)免疫抑制功能起到至關(guān)重要的作用。本課題通過免疫組化方法研究結(jié)直腸癌患者組織Foxp3的表達(dá)情況，探討其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院2014年1月至2014年11月行手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本45例，癌旁組織45例(距離腫瘤組織6 cm)。所有結(jié)直腸癌患者術(shù)前均未行放、化療或免疫靶向治療，其中男性28例，女性17例；年齡40-74歲(中位57歲)；術(shù)后病理診斷分期：T1+T2期21例，T3+T4期24例；Ⅰ+Ⅱ患者20例，Ⅲ+Ⅳ期患者25例；腫瘤分化程度：高中分化27例，低分化18例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。

1.2 免疫組化染色結(jié)直腸癌組織，癌旁組織石蠟切片，脫蠟，蒸餾水沖洗，0.3%H2O2液封閉，室溫下孵育10 min，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min。滴加適當(dāng)?shù)囊豢梗渭由锼鼗?，滴加鏈霉素抗生物素蛋?過氧化物酶溶液，27-37度20 min.DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。主要抗體包括：鼠抗人Foxp3單克隆抗體(Life Span Bioscience公司，美國)。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)免疫組化染色結(jié)果所有病理染色切片均有兩名病理科醫(yī)師參照相關(guān)免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行判定，陽性細(xì)胞胞漿或胞核染成棕黃色。采用半定量法依照染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分比進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度計(jì)分方法：無陽性染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性染色細(xì)胞構(gòu)成比計(jì)分方法：無陽性染色細(xì)胞0分，陽性細(xì)胞百分比≤10%為1分，陽性細(xì)胞百分比11%-50%為2分，陽性細(xì)胞百分比51%-75%為3分，陽性細(xì)胞百分比>75%為4分。最終評(píng)分為染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)與陽性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)的乘積。≥4分，則代表陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用卡方檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析兩種統(tǒng)計(jì)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P<0.05表示異常具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Foxp3在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)結(jié)直腸癌組織中Foxp3的陽性表達(dá)率71.1%(32/45)，癌旁組織的陽性表達(dá)率22.2%(10/45)，結(jié)直腸癌組織中Foxp3的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表 1，圖1。

表1 45例Foxp3在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)[例(%)]

A：癌組織Foxp3表達(dá) B：癌旁組織Foxp3表達(dá)

圖1 免疫組化技術(shù)檢測Foxp3在結(jié)、直腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 結(jié)直腸癌患者組織中Foxp3表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系結(jié)直腸癌組織中Foxp3的陽性表達(dá)率與腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤分期為Ⅲ期/Ⅳ期，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的Foxp3陽性表達(dá)率高于腫瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期，以及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與性別、年齡、分化程度、腫瘤浸潤深度無關(guān)，見表2。

3 討論

結(jié)直腸癌是全球男性第三高發(fā)，女性第二高發(fā)的腫瘤[1]，其發(fā)病率逐年增高。傳統(tǒng)的癌癥治療方法是以直接殺死腫瘤細(xì)胞為基礎(chǔ)，近年來，多種針對結(jié)直腸癌特定分子靶點(diǎn)和信號(hào)通路的靶向藥物進(jìn)一步提高了結(jié)直腸癌的療效。目前基于分子水平和靶向腫瘤微環(huán)境治療成為結(jié)直腸癌研究的熱點(diǎn)。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞( regulatory T cells，Tregs) 是一類具有免疫抑制功能的T 細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤組織內(nèi)浸潤，被認(rèn)為可促使腫瘤發(fā)生免疫逃逸，與腫瘤進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。2001 年[2]Brunkow 等首次報(bào)道Foxp3。最近研究表明Foxp3 在人類調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞上特異性表達(dá)( 主要在CD4+ CD25+ Treg 細(xì)胞上表達(dá),CD8+ CD25+Treg 細(xì)胞少量表達(dá)),因此,Foxp3 是CD4+CD25+Treg 細(xì)胞的特異性標(biāo)志。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)密切相關(guān),其中 CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg 細(xì)胞為主的抑制性T 細(xì)胞在腫瘤免疫中起著重要作用。目前Fox p3 是參與腫瘤微環(huán)境中抑制免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)基因,是腫瘤免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。

表2 45例結(jié)直腸癌組織中Foxp3的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[例(%)]

Foxp3被認(rèn)為是在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中作用最為突出的一種表面標(biāo)記蛋白，研究表明，其在人類不少的惡性腫瘤細(xì)胞中都有表達(dá)。本研究結(jié)果表明Foxp3在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.01)，F(xiàn)oxp3陽性表達(dá)率71.1%。與臨床報(bào)道大致相符[3]。國內(nèi)學(xué)者邱磊[4]報(bào)道，F(xiàn)oxp3在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，其過度表達(dá)可能是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與正常組織相比，結(jié)腸癌細(xì)胞中Foxp3表達(dá)增加，且高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)[5，6]。

本研究證實(shí)隨著結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期增加，F(xiàn)oxp3表達(dá)進(jìn)一步增加，腫瘤分期為Ⅲ期/Ⅳ期，以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中的Foxp3陽性表達(dá)率高于腫瘤分期Ⅰ期/Ⅱ期，以及淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度無關(guān)。關(guān)于本研究表明Foxp3表達(dá)水平與結(jié)直腸癌腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度無相關(guān)性，是否與本研究樣本量較少有關(guān)，要得到更為準(zhǔn)確的結(jié)論本研究尙需要納入更多的臨床病例。

本研究分析表明，F(xiàn)oxp3在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，有助于判斷結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移潛能，有望成為結(jié)直腸癌評(píng)估診斷的新靶點(diǎn)。