高 宇,沈 靜,宋蓮蓮,南光賢*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,吉林 長(zhǎng)春130033;2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院)

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)是由 140 個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì)，在正常情況下主要以可溶性的單體形式存在于神經(jīng)元[1]。然而，α-Syn 的代謝發(fā)生障礙，使其在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常積聚，進(jìn)而聚集成纖維而以包涵體的形式沉積在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[2]，形成突觸核蛋白病(α-synucleinopathy)包括帕金森病路易體癡呆(dementia with Lewy bodies，DLB)及多系統(tǒng)萎縮(multiple system atrophy，MSA)的標(biāo)志性病理改變。細(xì)胞凋亡是由機(jī)體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程，凋亡異常往往引起多種疾病,如癌癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病等[3]。因此，本研究將利用小鼠BV2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞株，通過體外研究技術(shù)，研究α-Syn寡聚體 對(duì)小鼠BV2 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BV2細(xì)胞購(gòu)自于武漢普諾賽生命科技有限公司,MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自于美國(guó) Hyclone 公司;胎牛血清由元亨生物科技有限公司提供； DMSO，北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，3-NP購(gòu)自于美國(guó) Sigma 公司(純度為 98%)，鹽酸司來吉蘭片購(gòu)自于山東綠葉制藥有限公司，α-synuclein(≥90%)購(gòu)自于美國(guó) Sigma 公司。主要儀器有細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本三洋公司產(chǎn)品；超凈臺(tái)，蘇州凈化儀器廠生產(chǎn)；倒置顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司產(chǎn)品。NIS-ELEMT BR圖像分析軟件，日本尼康。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠BV2細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基中,置于 37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng),其中加入 100 U/mL青霉素,100 mg/L鏈霉素。培養(yǎng) 24 h后換液。細(xì)胞傳代時(shí),先吸去瓶中的培養(yǎng)基,加入適量的 0.25%胰蛋白酶消化后輕輕吹打,以吹散細(xì)胞團(tuán),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2藥物處理 200 μmol/L α-synuclein 溶液的配制，準(zhǔn)確稱取 0.5 mg α-synuclein 溶于 173 μl緩沖液中。觀察細(xì)胞的變化。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按所需濃度接種，4 h后細(xì)胞完全貼壁，分別設(shè)為空白對(duì)照組，α-Syn組，α-Syn+司來吉蘭組，每組培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞進(jìn)行以下相應(yīng)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度均作8 個(gè)復(fù)孔,混勻培養(yǎng)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)四氮唑藍(lán)實(shí)驗(yàn)法(MTT 法)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞.分別以 1×104的濃度接種于 96 孔板,每孔 200 μl,置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育；按上述分組用藥物處理,在給藥后分別培養(yǎng) 24 h；達(dá)到預(yù)期培養(yǎng)時(shí)間前 4 h 終止培養(yǎng),每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl,37℃孵育4 h,去除上清液。 每孔加入 200 μl DMSO,充分吹打震蕩,待藍(lán)色顆粒完全溶解后用酶標(biāo)儀檢測(cè) 492 nm 的光密度值,計(jì)算存活率(存活率 =毒物作用組光密度值/正常對(duì)照組光 密度值 ×100%)。

1.4 采用TUNEl法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用6孔板制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛在常溫下固定30 min,PBS洗2 min×2次，蒸餾水洗滌2 min×2次，試驗(yàn)操作按武漢博世德生物技術(shù)有限公司試劑說明書進(jìn)行。TUNEL染色中細(xì)胞凋亡陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色位于細(xì)胞核內(nèi)，部分細(xì)胞漿也可因核DNA碎片的逸出呈陽(yáng)性著色；陰性細(xì)胞呈藍(lán)色。每張涂片在400X高倍鏡下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野下分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)并計(jì)算凋亡指數(shù)(Apoptosis Index,AI)，求其平均值。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。每個(gè)指標(biāo)做3次，每次TUNEL染色中以不含TdT的TdT buffer代替TUNEL反應(yīng)混合液作陰性對(duì)照。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè) bcl-2、 bax、caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)

采用6孔板制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定后，空氣中晾干，采用免疫組化染色觀察相應(yīng)蛋白表達(dá)。bcl-2、bax在胞質(zhì)中呈棕黃色陽(yáng)性表達(dá)；Caspase-3和 Caspase-9主要在胞質(zhì)中表達(dá)。以細(xì)胞未著色或輕微著色為陰性。每一指標(biāo)觀察3張細(xì)胞爬片，每張片在400X高倍鏡下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野下分別采用NIS-ELEMT BR分析陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)的平均光密度值。免疫細(xì)胞化學(xué)染色中以已知陽(yáng)性物質(zhì)的組織切片為陽(yáng)性對(duì)照，各組均以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MTT法測(cè)定α-Syn及司來吉蘭處理后BV2細(xì)胞增殖的影響

表1結(jié)果顯示，α-Syn終濃度20 mM可以抑制BV2細(xì)胞生長(zhǎng)，司來吉蘭100 μM可以明顯有效保護(hù)BV2細(xì)胞的生存(P<0.01)。

表1 司來吉蘭對(duì)抗α-Syn毒性的保護(hù)作用24hMTT結(jié)果

注：與α-Syn同濃度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，※※P<0.01。

2.2 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表2結(jié)果顯示，α-Syn終濃度20 mM可以導(dǎo)致BV2細(xì)胞凋亡，司來吉蘭100 μM可以明顯有效保護(hù)BV2細(xì)胞(P<0.01)。(見圖1-圖3)

圖1 對(duì)照組tunel(×400) 圖2 α-Syn組tunel(×400) 圖3 司來吉蘭+α-Syn tunel(×400)

表2 司來吉蘭對(duì)抗α-Syn細(xì)胞凋亡作用

注：與α-Syn同濃度細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較，※※P<0.01。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)

表3結(jié)果顯示，各組凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 、Caspase-9與Caspase-3均有表達(dá)，并且表達(dá)具有一致性，從視野內(nèi)的細(xì)胞著色的深淺可以看出表達(dá)程度的增多和表達(dá)量的增加；統(tǒng)計(jì)分析可知：司來吉蘭100 μM可以明顯有效減少BV2細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)量(P<0.01)。(見圖4-圖15)

表3 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)平均光密度值

注：與α-Syn同濃度數(shù)值比較，※※P<0.01。

圖4 對(duì)照組Bcl-2(×400) 圖5 α-Syn組Bcl-2(×400) 圖6 α-Syn+司來吉蘭Bcl-2(×400)

圖7 對(duì)照組Bax(×400) 圖8 α-Syn組Bax(×400) 圖9 司來吉蘭+α-Syn Bax(×400)

圖10 對(duì)照組caspase-3(×400) 圖11 α-Syn組caspase-3(×400) 圖12司來吉蘭+α-Syn caspase-3

(×400)

圖13 對(duì)照組caspase-9(×400) 圖14 α-Syn組caspase-9(×400) 圖15司來吉蘭+α-Syn caspase-9

(×400)

3 討論

α-突觸核蛋白的生理作用尚不明確。據(jù)報(bào)道它可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、突觸可塑性和遞質(zhì)的釋放以及參與某些信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)[4]。Seo等研究發(fā)現(xiàn)低濃度的α-突觸核蛋白具有神經(jīng)保護(hù)作用；高濃度的α-突觸核蛋白則表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用[5]。但是，α-Syn 在病理情況下的異常高表達(dá)是否影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡尚未明確。 本研究以BV2 細(xì)胞為模型，體外研究高水平的 α-突觸核蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。

在細(xì)胞凋亡的過程中， Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[6]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能分為抗凋亡基因及促凋亡基因，促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bok、Bad、Bid、Bim、Bmf、Bik、Hrk、Noxa、Puma等，抗凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、Bcl-B等，正常情況下抗凋亡蛋白發(fā)揮作用可抑制凋亡的發(fā)生，當(dāng)細(xì)胞受到損傷或脅迫時(shí)，抗凋亡蛋白功能受到抑制，而促凋亡蛋白發(fā)揮作用，從而引起細(xì)胞凋亡[7]。本結(jié)果表明，α-Syn 高表達(dá)導(dǎo)致bcl-2基因表達(dá)明顯降低，而Bax基因表達(dá)明顯升高，α-Syn組凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯增加，表明bcl-2/Bax參與α-Syn 高表達(dá)導(dǎo)致BV2 細(xì)胞凋亡，而司來吉蘭可以減少α-Syn 高表達(dá)誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞凋亡。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡必要的信號(hào)分子是一類半胱氨酸蛋白酶稱為Caspases家族。該家族共有十幾個(gè)成員，可以彼此之間互相活化形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8]。Caspases在凋亡程序的啟動(dòng)和執(zhí)行過程中起著重要作用，直接參與凋亡的早期啟動(dòng)、凋亡信號(hào)傳遞及凋亡晚期事件，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、膜出泡及DNA斷裂等凋亡特征現(xiàn)象[9]。即Caspases分為啟動(dòng)型和執(zhí)行型，前者接受死亡信號(hào)、啟動(dòng)凋亡或激活下游的分子，包括Caspases-2、Caspases-8、Caspases-9、 Caspases-10等；后者則降解細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)、核酸等，包括Caspases-3、 Caspases-6、Caspases-7等[10]。本研究結(jié)果表明，α-Syn 高表達(dá)導(dǎo)致Caspases-9、Caspases-3表達(dá)明顯升高，說明α-Syn誘導(dǎo)BV2細(xì)胞凋亡是通過線粒體細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 而司來吉蘭可以降低α-Syn 高表達(dá)導(dǎo)致的Caspases-9、Caspases-3表達(dá)升高，減少細(xì)胞凋亡。

本研究探討了α-Syn 高表達(dá)對(duì)BV2 細(xì)胞凋亡的作用，為揭示 PD 及 DLB 等與 α-Syn 相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的機(jī)制提供了線索。