肖鐘迪,王雅麗,付 凱

(1.大慶油田總醫(yī)院 普外科,黑龍江 大慶163001;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 輸血科; 3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科)

微小RNA(microRNA,miRNAs)是一類長約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,通過與靶mRNAs完全或不完全互補(bǔ)配對(duì),導(dǎo)致靶基因降解或抑制其翻譯,從而在基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。研究表明microRNAs參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的全過程[1,2]但是有關(guān)miR-218在肝癌(HCC)的生物學(xué)功能仍然未知,本研究將通過qRT-PCR方法檢測(cè)miR-218在肝癌細(xì)胞和肝癌組織的表達(dá)情況,以及探索miR-218對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響和具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系肝癌細(xì)胞系BEL-7402,MHCC97L,MHCC97H,QGY-7703,Huh7,HepG2,和正常肝細(xì)胞系THLE-2 購自ATCC公司(ATCC,USA)。所有的細(xì)胞系均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。

1.2miR-218模擬物(mimics)和陰性miRNA(miR-NC)購自廣州銳博有限公司(RiboBio,Guangzhou,China)。Hoxa10過表達(dá)載體pcDNA3.1-Hoxa10和對(duì)照載體pcDNA3.1購自Amspring(長沙,China)。各種細(xì)胞系種植到不同孔板中,起始密度約70%左右,細(xì)胞過夜之后,利用脂質(zhì)體2000(Thermo Fisher Scientific,USA)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染過程按照說明書進(jìn)行。

1.3 肝癌組織標(biāo)本本研究選取2011-2013年大慶油田總醫(yī)院普外科肝癌患者30名,均為漢族,其中男性17名,女性13名,年齡25-68歲。所有的樣本采集均獲得了患者知情同意,檢測(cè)完全符合大慶油田總醫(yī)院倫理道德標(biāo)準(zhǔn)并通過倫理審查。

1.4 RT-qPCR檢測(cè)利用TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific,USA)提取肝癌組織和肝癌細(xì)胞的RNA。TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成單鏈cDNA,TaqMan microRNA PCR (Thermo Fisher Scientific,USA)檢測(cè)miR-218表達(dá)情況。miR-218引物為5′-CGGGATCCGACCAGTCGCTGCGGGGCTTTCCTTTGTGCTTGATCTAACC-

ATGTGGTGGAACGATGGAAA-3′和5′-CCCA-

AGCTTTGCAGGAGAGCACGGTGCTTTC CGC-

GGTGCTTGACAGAACCATGTTCCGTTTCCA-

TCGTTC-3,U6作為對(duì)照microRNA。結(jié)果采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行miR-218定量分析,每個(gè)樣本至少重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 CCK-8檢測(cè)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CCK-8檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。約2000個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞種植到96孔板中,細(xì)胞孵育在37℃和5%的CO2孵育箱中。0,24,48,72 h孵育之后,每個(gè)細(xì)胞孔中分別加入10 μl的CCK-8 (Solarbio,中國),再次將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中孵育2 h,最后用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)獲取各組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并將其重懸到不含小牛血清的DMEM中,1×105細(xì)胞孵育到Matrigel凝膠包被的24孔板遷移小室的上層(Corning,USA),下層小室加入500 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。24 h孵育之后,侵襲細(xì)胞經(jīng)過4%多聚甲醛固定后,用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色,最后顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù),拍照并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 生物信息分析和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)利用生物信息學(xué)方法,應(yīng)用miRWalk,miRanda,TargetScan,miRDB等進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)?？寺oxa10基因野生型(wt)或突變型(mut)的3＇端非編碼區(qū)(3＇UTR),并將其連接到pGL3載體上。將肝癌細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中,待細(xì)胞生長到50%左右融合時(shí),利用lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染miR-218/miR-NC和pGl3-Hoxa10-wt/mut到肝癌細(xì)胞中。48 h后,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行測(cè)量。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.8Western blot RIPA裂解液提取細(xì)胞和組織的蛋白,蛋白質(zhì)經(jīng)過定量之后,經(jīng)過12%SDS-PAGE分離之后轉(zhuǎn)染至PDMF membrane (Millipore,USA)。5%脫脂奶阻塞1 h后,加入一抗在4℃過夜,二抗在室溫下孵育2 h。信號(hào)使用ECL Plus system (GE Healthcare,UK)檢測(cè)。Hoxa10和GAPDH抗體均購自Santa Cruz 公司(Santa Cruz,USA)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行t檢驗(yàn),數(shù)值用均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-218在肝癌組織和肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低利用RT-qPCR檢測(cè)了30例肝癌患者miR-218的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與癌旁正常組織相比,miR-218在肝癌患者中表達(dá)明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1A)；同時(shí),我們的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),與正常肝細(xì)胞相比,miR-218在肝癌細(xì)胞表達(dá)明顯降低,其中MHCC97H肝癌細(xì)胞降低最為明顯(見圖1B)。根據(jù)這些結(jié)果,我們?cè)诤罄m(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,使用的細(xì)胞系均為MHCC97H。這些結(jié)果表明miR-218降低可能與肝癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

A．肝癌組織中miR-218表達(dá).B 肝癌細(xì)胞中miR-218表達(dá)

2.2 miR-218過表達(dá)顯著降低了肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲通過miR-218 mimics和miR-NC作用在肝癌細(xì)胞MHCC97H中,CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與miR-NC相比,miR-218過表達(dá)顯著降低了肝癌細(xì)胞系的增殖(見圖2A)。遷移小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-218過表達(dá)顯著降低了肝癌細(xì)胞系的侵襲(見圖2B)。以上結(jié)果表明,miR-218過表達(dá)能夠降低肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

A.CCK-8實(shí)驗(yàn).B.遷移小室實(shí)驗(yàn)

2.3 Hoxa10可作為miR-218的直接靶點(diǎn)通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Hoxa10可能是miR-218的直接靶點(diǎn)(見圖3A)。熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在肝癌細(xì)胞系MHCC97H中,miR-218 mimics能夠顯著減低Hoxa10-wt的熒光素酶活性；而miR-218 mimics卻不能影響Hoxa10-mut的熒光素酶活性(見圖3B)。同時(shí),Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218 mimics能夠顯著降低Hoxa10在肝癌細(xì)胞MHCC97H的表達(dá)(見圖3C)。這些結(jié)果表明Hoxa10可作為miR-218抑制肝癌的直接靶點(diǎn)。

2.4 過表達(dá)Hoxa10部分抵消miR-218對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用我們進(jìn)行了拯救實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證miR-218通過作用Hoxa10起到抑制肝癌細(xì)胞的作用。我們利用pcDNA3.1-Hoxa10轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞MHCC97H中,CCK-8和遷移小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hoxa10過表達(dá)部分削弱了miR-218表達(dá)增高引起的肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果表明Hoxa10可以作為miR-218的直接靶點(diǎn)抵消miR-218對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。

A.靶點(diǎn)預(yù)測(cè).B.熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn).C.Western blot結(jié)果

3 討論

本研究首先利用RT-qPCR檢測(cè)了30例肝癌標(biāo)本和肝癌細(xì)胞miR-218的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-218在肝癌標(biāo)本和肝癌細(xì)胞中表達(dá)降低；接著,我們進(jìn)行了肝癌細(xì)胞增殖和侵襲實(shí)驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)miR-218過表達(dá)可以顯著降低肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲；以上結(jié)果表明miR-218可能具有參與肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

接著,為了進(jìn)一步研究miR-218抑制肝癌的分子機(jī)制,我們利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Hoxa10可能是miR-218的直接靶點(diǎn),并且通過熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證；拯救實(shí)驗(yàn)也表明過表達(dá)Hoxa10可以部分抵消miR-218對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用,以上結(jié)果表明,miR-218抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的主要機(jī)制是通過靶向抑制Hoxa10。

在其他的腫瘤研究中,wei[3]等發(fā)現(xiàn)miR-218在透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中表達(dá)降低,其抑制透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的主要是機(jī)制是靶向抑制蛋白磷酸酶2A。Li[4]等研究發(fā)現(xiàn)miR-218在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)降低,其抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞主要通過靶向調(diào)節(jié)ADD2。

A.CCK-8實(shí)驗(yàn).B.遷移小室實(shí)驗(yàn)

Xuan[5]等在骨肉瘤的研究發(fā)現(xiàn)miR-218表達(dá)降低,其抑制骨肉瘤細(xì)胞的主要機(jī)制是通過下調(diào)E2F2。此外,miR-218在宮頸癌中也表達(dá)顯著降低,其抑制宮頸癌生長和轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制是調(diào)節(jié)NF-κB 信號(hào)通路[6]。

綜上所述,miR-218通過靶向調(diào)節(jié)Hoxa10從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。后續(xù)有必要進(jìn)行小鼠肝癌移植瘤模型的研究,從而進(jìn)一步闡明miR-218參與肝癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本研究將為靶向miR-218治療肝癌提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。