于 軍,賀 丹,張 靈,李洪巖

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春130021)

病原微生物學(xué)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)中最重要的一門課程，也是比較特殊的一門醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程。病原微生物學(xué)實驗教學(xué)，也是當(dāng)今最受重視的一門教學(xué)。在醫(yī)學(xué)病原微生物實驗教學(xué)中，尤其病原腸道致病菌：傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌的生化鑒定的實驗教學(xué)，衛(wèi)生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》，將傷寒桿菌、痢疾桿菌病原微生物列為第二類病原微生物，屬高致病性病原微生物。根據(jù)《名錄的規(guī)定》，在實驗室操作中，腸道致病菌等應(yīng)在BSL-2或在ABSL-2實驗室進行[1-3]。

目前在國外世界衛(wèi)生組織(WHO為了指導(dǎo)實驗室生物安全，減少實驗室事故的發(fā)生，與1983年出版了《實驗室生物安全手冊》、各國各部門對生物安全要求都是硬性規(guī)定[4]。美國在1974年出版了《微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全手冊》首次提出了四級病原微生物危害和四級實驗室活動的概念，主要涉及職業(yè)衛(wèi)生、生物安保、風(fēng)險評估、部分農(nóng)業(yè)病原體、生物毒素等新內(nèi)容[5]。

我國發(fā)布的《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗室活動生物安全審批管理辦法》(衛(wèi)生部第50號令)中也強調(diào)：從事高致病性病原微生物實驗活動資格必須經(jīng)過審批，三、四級生物安全實驗室從事高致病性病原微生物實驗活動，必須取得衛(wèi)生部頒發(fā)的《高致病性病原微生物實驗室資格證書》[6-8]。

為了做好病原微生物學(xué)腸道桿菌的實驗教學(xué)，對病原微生物學(xué)腸道傷寒桿菌的減毒株的實驗研究迫在眉睫。

項目起源于醫(yī)學(xué)病原微生物學(xué)臨床五年制教學(xué)大綱,項目名稱為病原性腸道桿菌的分離鑒定(712045).現(xiàn)改革其實驗方法[9-12]。

1 材料與方法

1.1 傷寒桿菌臨床分離株、傷寒桿菌減毒株

傷寒桿菌臨床分離株(TH))由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系提供，(均為患者首次入院首次分離株)，傷寒桿菌減毒株(TY21a)、(PQ)由生物制品所提供。上述菌株經(jīng)法國梅里埃公司VITEK-32 微生物分析鑒定系統(tǒng)鑒定，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系實驗室保存。質(zhì)控菌株： 大腸埃希菌JM101，為基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系實驗室保存。

1.2 主要試劑

(1)培養(yǎng)基：S-S培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella Agar；產(chǎn)品編號：HB4089;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；克氏雙塘培養(yǎng)基(Kligler Iron Agar)：產(chǎn)品編號：HB6234;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；半固體培養(yǎng)基(Semisolid Agar)；產(chǎn)品編號：HB4168-3;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))；LB營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(LB Nutrient Agar,產(chǎn)品編號：HB0129;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；LB肉湯培養(yǎng)基(LB Broth),產(chǎn)品編號：HB0128;青島高科園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；腸道編碼生化鑒定管：杭州天和公司。

(2)其他：瓊脂糖(上海生工生產(chǎn))；PEG 8000(Merck公司生產(chǎn))；

1.3 主要儀器和設(shè)備

臺式離心機(上海安享科學(xué)儀器廠)；電子天平(JD400-3型：沈陽龍騰儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162，中儀國科(北京)科技有限公司)；恒溫孵育搖床,ES-60杭州米歐儀器有限公司。

微波爐(WD800AS-4，格蘭仕公司生產(chǎn))；潔凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；透射電鏡(HITACHI H-7650：日本株式會社日立電器有限公司生產(chǎn))；醫(yī)用低溫冰箱(MDF-U300，日本松下公司)；生物顯微鏡(E100型，日本尼康公司)；制冰機(北京長流科技有限公司生產(chǎn))。

2 方法

2.1 傷寒桿菌

傷寒減毒株的復(fù)蘇及培養(yǎng) (傷寒株—TH;傷寒減毒株：TY21a) 、(PQ)。

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種LB肉湯培養(yǎng)基于恒溫震蕩搖床過夜培養(yǎng)，24 h后取出，于LB瓊脂平板上分離劃，培養(yǎng)8-12 h(37℃)。注意觀察細菌生長狀態(tài)，培養(yǎng)完成后挑單菌落進行接種，接種S-S培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella Agar)，通常接種病原性腸道桿菌都選用鑒別培養(yǎng)基。因為S-S培養(yǎng)基成分中含有乳糖、中性紅指示劑及抑制非腸道致病菌生長的抑制劑。大腸埃希菌分解乳糖產(chǎn)酸，指示劑顯示成紅色。傷寒桿菌臨床分離株及傷寒減毒株不分解乳糖，生成透明菌落。有些腸道桿菌長生硫化氫，故有黑色生成。

圖1 傷寒減毒株P(guān)Q及TY21a 的對比性培養(yǎng)實驗

圖2 傷寒減毒株P(guān)Q及TY21a 與原傷寒臨床分離株TH

2.2 接種克氏雙糖培養(yǎng)基

傷寒桿菌及傷寒減毒株接種克氏雙糖培養(yǎng)基(Kligler Iron Agar)，37度24 h培養(yǎng)。圖2鐵雙塘培養(yǎng)基斜面含乳糖、產(chǎn)酸時候酚紅指示劑變黃，上層含有枸櫞酸銨鐵，故可看產(chǎn)生H2S,底部黑色及有無鞭毛。

2.3 傷寒桿菌及傷寒減毒株半固體培養(yǎng)基(Semisolid Agar)

用于觀察腸道菌的動力培養(yǎng)基。

半固體培養(yǎng)基可以觀察動力。產(chǎn)氣時培養(yǎng)基有氣泡或崩開，可以觀察傷寒桿菌動力。

表1 鐵雙塘培養(yǎng)傷寒桿菌及傷寒減毒株鑒定對比實驗

2.4 腸道編碼生化鑒定

2.5 腸道因子血清學(xué)鑒定對比試驗

沙門菌屬應(yīng)用已知的抗血清測定菌株的抗原成分，用已知的血清抗體與未知的腸道桿菌(抗原)進行玻片凝集試驗，定屬、定群、定種。通過細菌的培養(yǎng)特性及生化反映可以初步鑒定病原性腸道桿菌，只有通過血清學(xué)鑒定才能最后確定檢測細菌的屬、群、種。

表2 傷寒桿菌及傷寒減毒株生化鑒定對比

+為產(chǎn)酸產(chǎn)氣注：糖發(fā)酵試驗中，-為不發(fā)酵，+為產(chǎn)酸產(chǎn)氣

圖3 傷寒桿菌(TH)及傷寒減毒株(PQ)編碼鑒定對比

①沙門氏菌屬多價抗“O”血清

②沙門氏菌屬組抗“O”因子血清

③型抗“H”因子血清

方法：取一接種環(huán)診斷血清放于載玻片上，再從鐵雙塘培養(yǎng)基上取少許培養(yǎng)物充分研磨混勻，同時生理鹽水作對照。

結(jié)果：對照均勻渾濁。培養(yǎng)物與診斷血清室溫數(shù)分鐘后肉眼可見顆粒狀凝集，為陽性。經(jīng)過對比，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽性。

圖4 大腸埃希菌及編碼鑒定對照

圖5 傷寒桿菌(TH)及減毒株(TY21a)因子血清學(xué)鑒定

3 結(jié)果

實驗結(jié)果：S-S培養(yǎng)基傷寒桿菌及傷寒減毒株均生長，革蘭染色為革蘭陰性菌；鐵雙塘培養(yǎng)基均生長傷寒桿菌及傷寒減毒株；有H2S產(chǎn)生、有動力。血清學(xué)鑒定：診斷血清室溫數(shù)分鐘后肉眼可見顆粒狀凝集，傷寒桿菌及傷寒減毒株皆為陽性。由此得出結(jié)論：醫(yī)學(xué)生病原微生物學(xué)實驗課中腸道致病性桿菌的傷寒桿菌，可以用傷寒減毒株(Ty21a)或(PQ)取代[10，11]。這樣既可以保持病原微生物學(xué)實驗課學(xué)生的生物安全，醫(yī)學(xué)生可以學(xué)習(xí)到腸道致病菌的一系列生化特性，掌握全面的致病性腸道桿菌的生物學(xué)特性，又可以避免臨床分離株對師生造成感染。達到了基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)病原微生物學(xué)實驗課程的安全性、系統(tǒng)性、完整性[12，13]。