(三亞學(xué)院翟明國(guó)院士工作站， 海南三亞572000)

0 引言

景區(qū)開(kāi)發(fā)建設(shè)及游客踩踏等人為活動(dòng)的頻繁干擾會(huì)對(duì)景區(qū)內(nèi)環(huán)境造成顯著影響[1-3]，如景區(qū)開(kāi)發(fā)及旅游活動(dòng)會(huì)對(duì)旅游地植被、動(dòng)物、土壤環(huán)境產(chǎn)生不同程度的影響[4-7]。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由于細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，傳統(tǒng)研究方法難以全面分析其自然狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)特征和多樣性情況，近年來(lái)應(yīng)用較廣的Illumina高通量測(cè)序技術(shù)能夠利用從土壤樣本中直接獲取的DNA構(gòu)建文庫(kù)并測(cè)序，在研究微生物群落結(jié)構(gòu)方面優(yōu)勢(shì)明顯。土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境(如：養(yǎng)分、溫度、水分等)關(guān)系密切，土壤利用方式改變會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性相應(yīng)變化?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)比細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及時(shí)了解土壤生態(tài)環(huán)境的變化進(jìn)而及時(shí)調(diào)整土地利用方式、保護(hù)土壤生態(tài)環(huán)境。目前，針對(duì)旅游活動(dòng)對(duì)土壤環(huán)境影響方面的研究還比較少，僅有的研究主要集中于對(duì)土壤環(huán)境的宏觀影響方面，旅游活動(dòng)對(duì)土壤微生物的影響研究較為缺乏[8-9]，旅游景區(qū)開(kāi)發(fā)、游人踩踏等人為干擾對(duì)景區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。

位于虎豹嶺山脈的三亞臨春嶺森林公園于2013年1月開(kāi)工建設(shè)，并于2014年9月正式建成開(kāi)園，現(xiàn)在已經(jīng)成為三亞市民和游客最主要的健身旅游活動(dòng)場(chǎng)所之一。本研究選取臨春嶺森林公園為研究對(duì)象，調(diào)查分析不同程度的景區(qū)開(kāi)發(fā)及人為干擾對(duì)土壤微生物生態(tài)環(huán)境的影響，以期從微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的角度分析旅游干擾活動(dòng)對(duì)土壤微生物的影響，為旅游景區(qū)合理開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

三亞臨春嶺森林公園(109°31′40″E～109°32′07″E, 18°15′52″N～18°16′35″N)位于三亞市鳳凰路臨春嶺路段北側(cè)，北面與海螺農(nóng)場(chǎng)相接, 山脈呈南北走向，園區(qū)占地面積187 hm2，海拔最高點(diǎn)約195.6 m，氣候類型為熱帶海洋性氣候，年均溫為25.4 ℃，年均降雨量1 500 mm。土質(zhì)類型主要為山地赤紅壤，土壤質(zhì)地較為黏重，山上森林覆蓋率達(dá)65 %，主要由窿緣桉(Eucalytus exserta F.)、大葉相思(Acacia auriculiformis A.)及其他灌木構(gòu)成的人工成熟林[10]。公園建成開(kāi)園以來(lái)每天接待游客超千人，高峰期超5 000人，旅游干擾對(duì)景區(qū)土壤環(huán)境產(chǎn)生一定影響。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

臨春嶺森林公園主景區(qū)從登山平臺(tái)到瞭望塔鋪設(shè)寬2 m左右的石板路作為登山步道供游人行走，石板路兩側(cè)0～3 m定為游人干擾區(qū)，主要栽植低矮灌木和花卉，種植品種主要有蟛蜞菊(Wedeliachinensis(Osbeck.) Merr.)、朱瑾(Hibiscusrosa-sinensisLinn.)、九里香(MurrayaexoticaL.)、金鳳花(Caesalpiniapulcherrima(L.) Sw.)、水鬼蕉(Hymenocallislittoralis(Jacq.) Salisb.)等；外圍10～30 m是景觀綠化區(qū)，以觀賞樹(shù)木火焰木(SpathodeacampanulataBeauv.)、翅莢決明(CassiaalataLinn.)等替代原有喬木樹(shù)種方式進(jìn)行人工綠化改造；最外圍是人工成熟林區(qū)，以高大喬木窿緣桉和大葉相思為優(yōu)勢(shì)樹(shù)種為主，其間分布低矮灌木。

本研究于2017年1月份沿登山步道自登山平臺(tái)向上約200 m長(zhǎng)的步道兩側(cè)隨機(jī)取樣，根據(jù)游人活動(dòng)范圍及景區(qū)開(kāi)發(fā)建設(shè)情況，按照距離登山步道由近及遠(yuǎn)分為游人干擾區(qū)(L1)、景觀綠化區(qū)(L2)、人工成熟林區(qū)(L3)，每個(gè)區(qū)域分別取樣。其中，游人干擾區(qū)(L1)緊挨步道0～3 m[11-12]，主要以人工種植的灌木及花卉為主，游人干擾較明顯；景觀綠化區(qū)(L2)距步道10～30 m，主要以人工種植的觀賞樹(shù)木為主，游客有一定干擾影響；人工成熟林區(qū)(L3)距步道100～150 m，主要樹(shù)種為窿緣桉及大葉相思。采用隨機(jī)取樣法，每個(gè)取樣區(qū)分別隨機(jī)選取10個(gè)采樣點(diǎn)，去除表層枯枝落葉用土壤取樣器挖取0～15 cm的上層土壤，土樣分別充分混勻后過(guò)篩，按照“四分法”對(duì)樣品縮分后分成兩份，一份保存于-20 ℃冰箱并盡快完成細(xì)菌測(cè)序分析，另一份自然風(fēng)干后測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

2.2 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤理化性質(zhì)測(cè)定參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》[13]，土壤含水量采用烘干法，土壤容重采用環(huán)刀法，土壤pH采用酸度計(jì)法，土壤全碳采用重鉻酸鉀法，土壤全氮采用凱氏定氮法。

2.3 土壤總DNA的提取及rDNA PCR擴(kuò)增

土壤總DNA提取利用土壤DNA提取試劑盒(Power Soil DNA Isolate Kit，美國(guó)mobio公司)，提取的總DNA用1.2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取質(zhì)量。采用土壤細(xì)菌V3～V4區(qū)通用引物(336F: 5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′; 806R: 5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增目的片段。PCR體系反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，45 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，富集擴(kuò)增產(chǎn)物，并切膠純化[14]。

2.4 測(cè)序及數(shù)據(jù)分析處理

擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣東南芯醫(yī)療科技有限公司進(jìn)行MiSeq文庫(kù)構(gòu)建及Illumina測(cè)序。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0)去除過(guò)短序列、嵌合體等低質(zhì)量序列，按97 %的序列相似度進(jìn)行歸并及OTUs (Operational taxonomic units)劃分。采用Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)獲取門(mén)分類水平分布情況。利用R 3.1.2軟件計(jì)算各樣本(組)共有OTU的數(shù)量，并通過(guò)Venn圖直觀地呈現(xiàn)各樣本(組)共有和獨(dú)有OTU所占比例。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化特性分析

本次調(diào)查對(duì)比了三個(gè)區(qū)域土壤理化指標(biāo)，L1區(qū)土壤含水量最高，L2居中，L3含水量最低，可能是由于取樣時(shí)間正值三亞的旱季，降水不足導(dǎo)致自然成熟林區(qū)土壤含水量較低，而游人干擾區(qū)和景觀綠化區(qū)種植了大量人工花卉和綠化樹(shù)種人工灌溉頻繁，因此土壤含水量較高；由于受到游人踐踏的影響L1區(qū)的土壤容重明顯高于其他區(qū)域；人工種植的花卉、觀賞樹(shù)木能獲得定期人工補(bǔ)充肥料可能是L1區(qū)的全氮、全磷含量顯著高于其他區(qū)域的原因；而碳氮比三個(gè)區(qū)域沒(méi)有顯著差異。具體見(jiàn)表1。

表1 不同取樣點(diǎn)土壤理化性質(zhì)差異Tab.1 Chemical properties of soil in three regions

3.2 測(cè)序文庫(kù)評(píng)價(jià)

通過(guò)Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三個(gè)取樣地的土壤細(xì)菌16s rRNA的V3～V4區(qū)測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列質(zhì)量?jī)?yōu)化控制后，三個(gè)取樣地共獲得134 713條序列，L1、L2、L3分別得到45 941、42 876、45 896條序列，三個(gè)取樣點(diǎn)的土壤測(cè)序文庫(kù)基本達(dá)飽和，圖1顯示三個(gè)樣地的稀釋性曲線均趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)合理。

3.3 土壤細(xì)菌群落的韋恩圖分析

如圖2所示，三個(gè)區(qū)域的OTU數(shù)一共為1 936個(gè)。L3區(qū)的OTU數(shù)目最多為1 195個(gè)，L1和L2區(qū)域的OTU數(shù)目接近，分別為955和923個(gè)；其中，L1區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為348個(gè)，L2區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為318個(gè)，L3區(qū)獨(dú)有OTU數(shù)為557個(gè)；三個(gè)樣地的共有OTU數(shù)目為424個(gè)，約占OTU總數(shù)的21.9 %。由此可知，較少被擾動(dòng)的人工成熟林區(qū)土壤細(xì)菌OTU數(shù)量更豐富，而行道旁游人干擾區(qū)和景觀綠化種植區(qū)的土壤微生物豐度略有降低。

圖1 三個(gè)土壤樣品的稀釋曲線
Fig.1 Rarefaction curves of three soil samples

圖2 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌OUT數(shù)量的Venn圖
Fig.2 Venn diagram of OTU number in three regions

3.4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

臨春嶺森林公園三個(gè)區(qū)域的土壤共檢測(cè)到13個(gè)細(xì)菌門(mén)，三個(gè)區(qū)域共有的細(xì)菌門(mén)類為：Proteobacteria變形菌門(mén)、Actinobacteria放線菌門(mén)、Acidobacteria酸桿菌門(mén)、Chloroflexi綠彎菌門(mén)、Firmicutes厚壁菌門(mén)、Planctomycetes浮霉菌門(mén)、Bacteroidetes擬桿菌門(mén)、Nitrospirae硝化螺菌門(mén)、Verrucomicrobia疣微菌門(mén)、Gemmatimonadetes芽單胞菌門(mén)。其中，Proteobacteria變形菌門(mén)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，特別是L1區(qū)和L2區(qū)分別占到96.7 %和96.5 %。其中的Latescibacteria和Cyanobacteria(藍(lán)細(xì)菌)兩個(gè)細(xì)菌門(mén)類為L(zhǎng)1區(qū)特有；armatimonadetes為L(zhǎng)2區(qū)特有。賀曉凌等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)Latescibacteria是近垃圾池的土壤中特有的門(mén)類，并認(rèn)為此微生物門(mén)類或許與垃圾降解相關(guān)。Latescibacteria在本研究中為L(zhǎng)1區(qū)特有門(mén)類，或許進(jìn)一步顯示此細(xì)菌門(mén)類與人類活動(dòng)關(guān)系密切。

3.5 土壤細(xì)菌相似度聚類分析

基于Unweighted UniFrac距離對(duì)三個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析(圖4)，結(jié)果顯示，L1和L2高度相似，可聚為一類，說(shuō)明L1和L2細(xì)菌群落趨同性更高，而L3則距離相對(duì)較遠(yuǎn)。表明旅游干擾區(qū)及人工綠化區(qū)的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似。

圖3 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌門(mén)組成
Fig.3 Relative abundances of bacterialphyla in three regions

圖4 三個(gè)區(qū)域土壤細(xì)菌群落相似性分析
Fig.4 Similarity of bacterial communitystructure between three regions

3.6 土壤細(xì)菌的結(jié)構(gòu)差異分析

圖5 三個(gè)區(qū)域土壤OTU主成分分析Fig.5 Principal component analysis of OTU in three regions

對(duì)三個(gè)區(qū)域的土壤細(xì)菌進(jìn)行了PCA分析，由圖5知第一主軸的貢獻(xiàn)率達(dá)到94.83 %，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；第二主軸的貢獻(xiàn)率僅為5.17 %。L1與L2在第一主軸上最為接近，表明相似度更高，而L3與另兩個(gè)區(qū)域土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異更大。

4 討論

土壤細(xì)菌占土壤微生物總量的70 %～90 %，對(duì)土壤的物質(zhì)循環(huán)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，土壤利用方式的改變會(huì)導(dǎo)致土壤細(xì)菌類群的結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化。旅游開(kāi)發(fā)改變了土地利用方式，此外游人踐踏等旅游活動(dòng)的干擾增加土壤的壓力、加劇土地磨損，不僅會(huì)降低該地區(qū)動(dòng)植物的數(shù)量和多樣性，也對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生顯著影響。李會(huì)琳等[16]研究發(fā)現(xiàn)森林土壤變更為茶園土壤后，菌群多樣性指數(shù)以及菌群OTUs都顯著降低。劉光榮[17]研究發(fā)現(xiàn)廬山景區(qū)原始森林區(qū)土壤微生物群落代謝活性最強(qiáng)，而旅游干擾大的區(qū)域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，代謝活性減弱。段青倩等[18]證實(shí)旅游活動(dòng)會(huì)顯著降低五臺(tái)山山地草甸土壤物質(zhì)循環(huán)和轉(zhuǎn)化能力，并進(jìn)一步影響五臺(tái)山草甸植被的多樣性及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。旅游活動(dòng)對(duì)張家界森林公園的土壤生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了顯著影響，其中，細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量與旅游活動(dòng)干擾強(qiáng)度顯著相關(guān)，隨著旅游活動(dòng)干擾強(qiáng)度增大，微生物數(shù)量顯著降低[19]。

本研究結(jié)果表明，土壤細(xì)菌的豐度和多樣性整體表現(xiàn)為L(zhǎng)3>L2>L1，成熟林區(qū)土壤微生物多樣性最高，而人工林區(qū)和人工綠化區(qū)微生物更相近，與前人的相關(guān)研究結(jié)論一致，進(jìn)一步證明人工景觀綠化及游人干擾會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生一定影響。本次研究結(jié)果顯示三個(gè)區(qū)域土壤微生物種類中變形菌門(mén)(Proteobacteria)均占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，變形菌門(mén)中包括了大量參與土壤氮、磷、硫和有機(jī)物代謝循環(huán)相關(guān)的細(xì)菌種類。劉洋等[20]通過(guò)454 高通量測(cè)序研究黃土高原不同喬木林土壤細(xì)菌群落，結(jié)果顯示4 種喬木林下變形菌門(mén)(Proteobacteria)是最主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

研究結(jié)果中變形菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其他細(xì)菌門(mén)類占比相對(duì)較小或許與臨春嶺優(yōu)勢(shì)樹(shù)種窿緣桉有關(guān)，窿緣桉根系分泌物及凋落物會(huì)對(duì)林區(qū)土壤細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生影響[21-22]，其釋放的某些化學(xué)物質(zhì)會(huì)抑制林內(nèi)其他植物的生長(zhǎng)進(jìn)而導(dǎo)致林區(qū)內(nèi)群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單[23]。研究結(jié)果也表明三個(gè)區(qū)域發(fā)現(xiàn)的個(gè)別門(mén)類為某個(gè)區(qū)域特有，如Latescibacteria為L(zhǎng)1區(qū)獨(dú)有，L1區(qū)距離步道最近，最易受到游人踩踏等影響，其土壤容重顯著高于其他區(qū)域，同時(shí)人工養(yǎng)護(hù)也造成靠近步道的區(qū)域土壤水分和養(yǎng)分含量較高，可能會(huì)對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，這或許表明此細(xì)菌門(mén)類與人類活動(dòng)關(guān)系密切[15]。研究結(jié)果進(jìn)一步證明旅游活動(dòng)及人工綠化改造會(huì)對(duì)土壤微生物種群產(chǎn)生一定影響。

5 結(jié)論

①利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)三亞臨春嶺森林公園三個(gè)區(qū)域土壤的細(xì)菌多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，三個(gè)區(qū)域共獲得1936個(gè)OTU，分屬于20個(gè)門(mén)，此外還有部分未分類細(xì)菌。景區(qū)土壤細(xì)菌群落多樣性表現(xiàn)為：人工成熟林區(qū)>景觀綠化區(qū)>游人干擾區(qū)。

②變形菌門(mén)(Proteobacteria)是土壤細(xì)菌群落中相對(duì)豐度最高的門(mén)類，在土壤細(xì)菌類群中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。細(xì)菌門(mén)類相對(duì)單一或許與櫞隆桉的化感作用相關(guān)。