歐慧瑜 李瑞鵬 邵珍怡 郭秋平

(廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州 510240)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是由機械和生物因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和滑膜炎性病變?yōu)橹饕卣鞯穆约膊1-2]，導致患者出現(xiàn)疼痛和功能障礙，嚴重影響其生活質(zhì)量。建立一種能模擬OA發(fā)病過程的模型，對于篩選和評價治療OA的藥物非常重要。關(guān)節(jié)軟骨的直接損傷可以引起骨關(guān)節(jié)炎病變或軟骨再生，這主要取決于損傷的部位，損傷的大小和動物的年齡[3]。本研究中使用6月齡新西蘭兔，通過關(guān)節(jié)軟骨鉆孔致軟骨缺損成功制備了兔OA模型。

1 材料與方法

1.1 試劑

鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業(yè)股份有限公司)；6%戊巴比妥鈉；白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.2 實驗動物

新西蘭兔(雌雄各半，6月齡)，由山東濟南金豐實驗動物有限公司提供(許可證號SCXK(魯)2014-0006)。動物飼養(yǎng)于普通級動物房，溫度16～26 ℃，相對濕度40%～70%，12 h照明/12 h黑暗交替，動物自由攝食和飲水。本實驗遵守廣東省實驗動物保護和使用指南，并經(jīng)藥物非臨床評價研究中心的實驗動物倫理委員會批準。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；3-18k高速冷凍離心機(德國Sigma公司)；Elx800酶標儀(美國Bio Tek公司)；病理切片機(德國Leica公司)，OLYMPUS BX41 顯微鏡和DP71+IPP6.0圖像采集系統(tǒng)。

1.4 實驗方法

1.4.1動物分組:將檢疫合格的動物，根據(jù)體質(zhì)量和性別隨機分成3組：假手術(shù)組，模型組和陽性對照藥氨基葡萄糖(劑量為0.034 g/kg)組，每組12只，雌雄各半。每天觀察各組動物的食量、大小便、精神狀態(tài)等。

1.4.2造模方法:取36只新西蘭兔，用6%戊巴比妥鈉(0.7 mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉動物。左側(cè)膝部內(nèi)側(cè)縱向切口，長約2 cm，將髕骨翻向外側(cè)，顯露髕骨關(guān)節(jié)面。檢查膝關(guān)節(jié)腔有無積液或粘連，關(guān)節(jié)軟骨平坦，色澤正常后，先用直徑2 mm鉆頭在膝關(guān)節(jié)屈曲90°時髕骨所對應(yīng)股骨內(nèi)、外側(cè)髁間關(guān)節(jié)面中部初步定位，鉆出小凹陷，然后換4.2 mm的鉆頭在此基礎(chǔ)上鉆出直徑4.2 mm、深3 mm的關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)。將髕骨復位，逐層縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚切口。術(shù)后立即肌肉注射青霉素鈉以防止感染。假手術(shù)組的動物僅暴露髕骨不鉆孔，其余操作方法與上述描述相同。造模4周后，各組動物開始灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥4周。各組動物的給藥體積均為10 mL/kg。假手術(shù)組和模型組給予相同體積的CMC-Na溶液。

1.5 檢測指標

1.5.1血清和關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α檢測:末次給藥后，動物靜脈采血，靜置2 h后，分離血清，置于-20 ℃冰箱保存待測。用注射器抽取1 mL生理鹽水注入關(guān)節(jié)腔沖洗，抽出沖洗液，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于-20 ℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說明書，檢測血清和關(guān)節(jié)液IL-1β和TNF-α水平。

1.5.2組織病理學觀察:采血結(jié)束后，處死動物，將各組動物造模側(cè)的關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織用4%甲醛溶液固定，脫水，包埋，切片后進行HE染色。參照Mankin’s評分標準對關(guān)節(jié)軟骨進行評分[4]，驗證OA模型是否復制成功。

1.6 統(tǒng)計方法

結(jié)果以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。用單因素方差分析(ANOVA)進行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett法進行多個劑量組與陰性對照組間的兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α水平

造模8周后，模型組動物血清、關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；而連續(xù)4周給予氨基葡萄糖后，動物血清、關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，結(jié)果見表1。

表1 動物血清、關(guān)節(jié)液中IL-1β和TNF-α水平Table 1 L-1βbeta and TNF-α in the serum and joint

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note: compared with model,#P<0.05; compared with sham,*P<0.05

2.2 關(guān)節(jié)軟骨HE染色

造模8周后，假手術(shù)組動物關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織正常，關(guān)節(jié)面完整，無炎細胞浸潤；模型組動物軟骨表面不連續(xù)，交界處有裂隙，兩端整合不良，潮線模糊不清；氨基葡萄糖組動物損傷部位以纖維組織增生為主，內(nèi)有多量軟骨細胞，軟骨表面連續(xù)，交界處無裂隙，兩端整合良好，結(jié)果見圖1。

圖1 兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理圖(HE染色)Fig.1 Pathology of articular cartilage of Rabbit Knee Joint

2.3 關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分

造模8周后，模型組動物軟骨組織評分為7.3分，與假手術(shù)組相比明顯升高(P<0.05)。連續(xù)4周給予氨基葡萄糖后，動物軟骨組織評分為5.1分，與模型組相比明顯降低(P<0.05)，結(jié)果見表2。

2.4 滑膜組織HE染色

造模8周后，假手術(shù)組動物滑膜襯層細胞未見增生、肥大、炎細胞浸潤；模型組動物滑膜襯層細胞增生、肥大，全層均有顯著炎細胞浸潤；氨基葡萄糖組動物滑膜襯層細胞增生、肥大，伴有少量炎細胞浸潤。結(jié)果見圖2。

表2 關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評分Table 2 Mankin’s score of articular

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

Note: compared with model,#P<0.05; compared with sham,*P<0.05

圖2 兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理圖(HE染色)Fig.2 Synovial Histopathology of Rabbit Knee Joint

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是慢性、退變性的關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于中老年人群，導致患者的生活能力喪失甚至殘疾。隨著社會人口老齡化，每年的OA患者人數(shù)都在增加，給社會造成了沉重的經(jīng)濟負擔[5]。目前臨床上常用的藥物如鹽酸氨基葡萄糖、非甾體類抗炎藥，僅能緩解癥狀，而且長期服用還會出現(xiàn)胃腸道不適等不良反應(yīng)[6]。因此，迫切需要研究OA的發(fā)病機制，開發(fā)新的治療藥物。

理想的OA動物模型應(yīng)該有大小、結(jié)構(gòu)、軟骨損傷、疾病進程等都與人類相似的關(guān)節(jié)，采用相同的誘導方法可成功復制模型，而且動物的年齡能模擬OA患者[7]。目前常用的OA模型制備方法有手術(shù)法和非手術(shù)法，非手術(shù)法有化學法、自發(fā)性、轉(zhuǎn)基因模型等[8]。近年采用較多的方法是手術(shù)法，如Hulth模型[9]、改良的前交叉韌帶切斷模型[10]等，通過手術(shù)可迅速造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)而誘導OA，損傷嚴重，不能模擬OA慢性疾病的發(fā)病進程，不利于表現(xiàn)藥物的干預(yù)作用?；瘜W法是在關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶、膠原酶等[11-12]，但是造模程度難以確定。自發(fā)性O(shè)A模型動物更接近OA的發(fā)病進程，但是耗費時間較長，成本較高[13]。轉(zhuǎn)基因模型通過編輯基因獲得基因缺陷的動物，可用于研究特定基因在OA發(fā)病中的作用，但成本較高。

OA最初是以關(guān)節(jié)軟骨損傷為主，研究表明狗關(guān)節(jié)軟骨缺陷(1.5 mm直徑，0.5 mm深度)3周后可形成溫和的OA病變[14]。這種模型接近OA發(fā)病過程，損傷較輕，造模程度可以控制，也可用于其他種屬動物，如嚙齒類動物，兔，馬等[3]。本研究采用兔關(guān)節(jié)軟骨鉆孔造成軟骨缺陷(4.2 mm直徑，3 mm深度)，造模8周后，模型組出現(xiàn)軟骨結(jié)構(gòu)改變，缺損和滑膜炎細胞浸潤等OA的特征，而且陽性藥物可以改善模型的這些癥狀。因此，該模型可為治療OA藥物的評價提供參考。