相 磊 陳 華 趙德明

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100093)(2. 中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心，北京 100853)

近年來，肥胖與糖尿病的發(fā)病率逐年增高，其中糖尿病已成為全球性疾病，目前僅次于心腦血管病和癌癥，列為第三位大病。2017年，國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)發(fā)布了第八版全球糖尿病地圖。新版地圖顯示，目前全球有4.25億糖尿病患者，預(yù)計到2045年，將會有近7億糖尿病患者。我國原是糖尿病低發(fā)區(qū)，但是近年來發(fā)病率也以驚人的速度激增。抽樣調(diào)查顯示，我國糖尿病患者9240萬(2007-07—2008-05)，每年新增患者680萬，處于世界最高水平[1]。2型糖尿病人占糖尿病人總數(shù)的90%～95%左右，是糖尿病所有分型中的主要組成部分[2]。肥胖與2型糖尿病之間存在密切的關(guān)系，一方面肥胖是2型糖尿病發(fā)生的一個獨立危險因子；另一方面2型糖尿病患者中約有三分之二超重或者肥胖。

由于維持費(fèi)用低廉、基因組序列清楚而且便于用遺傳工程手段修飾等特點，嚙齒類動物模型一直是糖尿病和肥胖研究的主要工具。嚙齒類肥胖模型包括自發(fā)性動物模型如C57BL/6J-ob/ob小鼠、C57BL/KsJ-db/db小鼠和Zucker-fa/fa 大鼠；誘發(fā)性肥胖大鼠模型主要通過高能量飲食誘導(dǎo)，一般高脂飼料誘導(dǎo)3個月可誘發(fā)出肥胖模型；遺傳修飾改造致動物肥胖模型如Mc4RTGEM大鼠、Agouti基因突變小鼠、Tubby基因突變小鼠等。然而，由于人類和嚙齒類動物之間存在明確的代謝和生理差異，特別是在新陳代謝和脂肪組織生物學(xué)方面差異顯著，如脂肪酶在肥胖小鼠中含量低而在肥胖人群中含量較高；小鼠中和TNF-α作用可改善胰島素抵抗而在人群內(nèi)中和其作用則對胰島素抵抗無影響；肥胖小鼠中抵抗素水平損害糖耐量和胰島素敏感性而在人群中水平的高低不反應(yīng)胰島素抵抗或肥胖[3]。這些差異無疑減緩了肥胖和糖尿病的研究成果向臨床的轉(zhuǎn)化。隨著人們對豬與人類在生理和解剖方面相似性認(rèn)識的不斷深入，尤其發(fā)現(xiàn)在代謝方面存在高度的一致性[4]，現(xiàn)在普遍認(rèn)為小型豬是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究成果向臨床轉(zhuǎn)化的橋梁。應(yīng)用小型豬建立動物模型開展肥胖相關(guān)研究與嚙齒類動物模型相比更能模擬人類疾病的發(fā)生與發(fā)展的過程。

本實驗應(yīng)用高脂高糖飼料飼喂動物，同時限制動物活動(單籠飼養(yǎng))，觀察是否能夠誘導(dǎo)小型豬肥胖，以及進(jìn)一步發(fā)生糖尿病的情況，為小型豬在代謝性疾病研究領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

巴馬小型豬14頭，8月齡，體質(zhì)量25～26 kg。其中實驗組8頭飼喂高糖高脂飼料，對照組6頭飼喂常規(guī)飼料，連續(xù)飼喂30周。

1.2 實驗儀器

飛利浦64排螺旋CT(PHILIPS，荷蘭)，Eppendorf 5180冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)，東芝120型全自動生化分析儀(東芝株式會社，日本)。

1.3 實驗方法

實驗組8頭巴馬小型豬，連續(xù)飼喂高脂高糖飼料30周。高糖高脂飼料配方：蔗糖35%、牛油10%、基礎(chǔ)飼料55%。基礎(chǔ)飼料配方：玉米48%、小麥次粉20%、大豆餅15%、稻米糠12%、魚粉5%。誘導(dǎo)飼料碳水化合物、脂肪和蛋白的能量占比分別為73.6%、11.3%和15.1%。在飼喂至第30周，做以下檢測：

體質(zhì)量與體形系數(shù)：應(yīng)用鹽酸氯胺酮與陸眠寧(體積比1∶1)按照0.3 mL/kg肌肉注射，對小型豬實施全身麻醉后稱重。量取胸圍、腹圍以及體長。并計算身體型指數(shù)(Body Mass Index,BMI)。BMI=BW (kg)/{π/3×length×[(TC/2π)2+(AC/2π)2+(TC/2π × AC/2π)]}[5]。

CT掃描：飛利浦64位CT掃描(層厚10 mm，矩陣512х512，窗寬500HU，窗位40HU，掃面參數(shù)125 kV，50～100 mAS)，比較對照與高脂高糖飼料誘導(dǎo)組巴馬小型豬機(jī)體的脂肪含量、內(nèi)臟脂肪的含量和胰腺的體積。

血清生化指標(biāo)：巴馬小型豬麻醉后，取后肢備皮，小型豬大腿近心端綁扎止血帶，75%醫(yī)用酒精消毒，外側(cè)隱靜脈穿刺采血約5 mL。血液置于促凝離心管內(nèi)，應(yīng)用Eppendorf 5180冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)， 4 ℃，1 500 r/min 10 min，取上清液。東芝120型全自動生化分析儀(東芝株式會社，日本)，進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測。

2 結(jié)果

2.1 體型系數(shù)

高脂高糖飼料飼喂30周后，實驗組動物與對照組動物體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，BMI差異顯著(P<0.05)(表1)，而動物的腹圍、體長、胸圍等指標(biāo)差異不顯著(P>0.05)。

表1 高脂高糖飼料飼喂巴馬小型豬30周 動物體質(zhì)量與體型系數(shù)Table 1 Body weight and BMI of Bama miniature pigs fed for 30 weeks by high-fat and high-sugar diets

注：高脂高糖組與正常飲食組比較差異顯著,*P<0.05

Note：There was a significant difference between the high-fat and high-sugar group and the normal diet group,*P<0.05

2.2 CT掃描

CT檢查結(jié)果表明，高脂高糖飼料誘導(dǎo)組動物機(jī)體脂肪含量明顯高于對照組(P<0.05，P=0.035)；內(nèi)臟脂肪占比實驗組明顯高于對照組(P<0.01，P=0.0028)；CT掃描實驗組與對照組胰腺體積差異不顯著(P>0.05，P=0.57)。

圖1 巴馬小型豬CT掃描Fig.1 CT scan of Bama miniature pig

圖2 巴馬小型豬CT掃描結(jié)果分析注:A.巴馬小型豬身體總脂肪含量CT掃描結(jié)果；B.巴馬小型豬內(nèi)臟脂肪含量CT掃描結(jié)果；C.巴馬小型豬胰腺體積掃描結(jié)果Fig.2 Analysis of CT scan results of Bama miniature pigsNote:A.The results of body fat content by CT scan in Bama miniature pigs;B.The results of visceral fat content by CT scan in Bama miniature pigs;C.The results of pancreatic volume by CT scan in Bama miniature pigs

2.3 血液生化指標(biāo)

高脂高糖飼料誘導(dǎo)30周后，實驗組巴馬小型豬與對照組相比血液生化指標(biāo)存在顯著性差異，表現(xiàn)為空腹血糖呈升高的趨勢，胰島素水平顯著升高(P<0.01)，HOMA-IR指數(shù)顯著升高(P<0.01)；總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和甘油三脂指標(biāo)顯著升高(P<0.01)，低密度脂蛋白膽固醇水平顯著升高(P<0.05)。其中，血清總膽固醇比對照組升高了1.88倍，HDL-C升高了2.69倍，LDL-C升高了1.03倍，甘油三脂升高了3.2倍；腎功能指標(biāo)中，血清蛋白、肌酸肝水平明顯升高，尤其以尿酸、尿素升高最為顯著(P<0.01)，顯示腎功能也出現(xiàn)損傷。

注：高脂高糖誘導(dǎo)組與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01

Note:High-fat and high-sugar induction group compared with control group,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

人體肥胖的發(fā)生是遺傳基因、飲食生活習(xí)慣、代謝紊亂及神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等因素共同作用的結(jié)果，尤其是能量供需失衡，內(nèi)分泌紊亂是造成肥胖的重要因素。肥胖與2型糖尿病、血脂異常關(guān)系最為緊密。中國超重與肥胖人群中罹患糖尿病患者比例分別為12.8%與18.5%，而在糖尿病患者中超重比例為41%、肥胖比例占24.3%[6]，由此可見肥胖與糖尿病之間存在緊密的聯(lián)系。有研究者通過對993名不同種族人群的BMI，脂肪分布，肌肉發(fā)達(dá)程度，骨骼礦物質(zhì)構(gòu)成，腿長等指標(biāo)進(jìn)行了研究，表明機(jī)體每超重1 kg，罹患糖尿病的機(jī)率將增加4.5%～9%[7-8]。董明等通過高脂飲食誘導(dǎo)C57b/6 L小鼠1周出現(xiàn)體質(zhì)量升高；4周后空腹血糖明顯升高；5周后胰島素水平明顯升高；8周后體質(zhì)量指數(shù)顯著升高，血清總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇顯著升高；10周后甘油三酯、血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇均升高表明該小鼠誘導(dǎo)成為肥胖模型[9]。本研究中巴馬小型豬連續(xù)飼喂高糖高脂飼料30周，動物明顯肥胖，表現(xiàn)為體質(zhì)量、BMI比對照組顯著升高(P<0.01)，這與嚙齒類與人類研究結(jié)果相一致，小型豬在發(fā)展為肥胖的同時，也出現(xiàn)了胰島素抵抗、血脂代謝紊亂和可能的腎損傷。因此，高糖高脂飼喂這種外源性的能量過剩，能夠誘發(fā)小型豬肥胖，并適用于肥胖和胰島素抵抗、代謝綜合征的研究。

胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是指對胰島素代謝效應(yīng)的抵抗，其中包括胰島素對內(nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生的抑制性效應(yīng)、胰島素對外周組織(主要是骨骼肌)葡萄糖攝取和糖原合成的刺激性效應(yīng)以及胰島素對脂肪分解的抑制性效應(yīng)。早期的2型糖尿病患者、肥胖的胰島素抵抗患者以及代謝綜合征的兒童中觀察到胰島素的降解減少是胰島素代謝障礙的主要早期表現(xiàn)。胰島素降解減少使循環(huán)的空腹和外周胰島素水平長期升高，進(jìn)一步加劇了胰島素抵抗。Haffner等采用微小模型法評價胰島素敏感性，對包括非洲裔、西班牙裔及非西班牙裔美國人3 個不同種族在內(nèi)共479 例2 型糖尿病人的研究結(jié)果表明，胰島素抵抗者占92%，證實胰島素抵抗在2 型糖尿病中普遍存在[10]。Shirai等通過高脂飼料飲食誘導(dǎo)出了大鼠的2型糖尿病動物模型，通過該模型研究表明肥胖與高脂飼料的飲食是引起胰島素抵抗與胰島細(xì)胞損傷的重要因素[11]。在高脂飼料誘導(dǎo)豬的肥胖模型中表明肥胖能夠引起胰島素敏感性的下降，主要表現(xiàn)為靜脈葡萄糖耐量試驗(IVGTT)、胰島素耐性試驗(ITT)以及胰島素敏感指數(shù)(HOMA-IR)發(fā)生改變，然而值得注意的是豬的空腹胰島素水平變化不大[12]。本研究中，小型豬連續(xù)飼喂高糖高脂飼料30周，空腹血糖呈現(xiàn)升高的趨勢，但是還未達(dá)到失代償?shù)某潭?，而胰島素卻顯著升高，HOMA-IR指數(shù)升高，表明已經(jīng)出現(xiàn)胰島素抵抗。

糖尿病與肥胖通常伴有機(jī)體組織的慢性炎癥和脂肪組織的代謝障礙。腹內(nèi)脂肪增加使胰島素介導(dǎo)的葡萄糖非氧化代謝減弱，胰島素刺激糖原合成能力減弱，同時抑制脂質(zhì)氧化和游離脂肪酸的能力被制止。在此基礎(chǔ)上機(jī)體為了維護(hù)體能糖平衡會分泌大量胰島素，致使胰島β細(xì)胞衰竭，胰島素分泌缺陷，最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生[13]。脂肪組織是一種內(nèi)分泌器官，研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗與脂肪沉積的部位有很大關(guān)系，內(nèi)臟脂肪含量過高易導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而發(fā)展成 T2DM。研究發(fā)現(xiàn)，腹圍與腹部總脂肪(TAV)、內(nèi)臟脂肪體積(VAV)和皮下脂肪組織(SAV)均有相關(guān)性，胰島素抵抗程度與VAV呈正相關(guān)，VAV的增高可加重胰島素抵抗，從而產(chǎn)生高胰島素血癥，而SAV與胰島素抵抗無相關(guān)性。醫(yī)學(xué)研究機(jī)體脂肪含量的測定方法有CT、MRI、超聲、雙能X線吸收法以及人體測量法等。然而CT掃描具有準(zhǔn)確、方便、可重復(fù)性高的特點，應(yīng)用它對于腹部脂肪含量的精確判定是最為理想的方法[14]。FontiFurnols 等研究表明通過CT橫斷層掃描分析不同品種豬的脂肪、肌肉與骨骼等能夠準(zhǔn)確評估機(jī)體成分的組成[15]。Lara Femandez 等通過83名男性與68名女性研究不同性別、不同年齡人群機(jī)體的脂肪沉積等狀況比較了人體物理測量與CT掃面分析的對應(yīng)關(guān)系，對預(yù)測肥胖的判定提供了參考數(shù)據(jù)[16]。Sandeep等[17-18]研究表明脂肪分布模式是胰島素抵抗發(fā)生的獨立風(fēng)險因子，而內(nèi)臟脂肪與胰島素抵抗呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，減少機(jī)體腹部脂肪對有效預(yù)防胰島素抵抗和炎癥發(fā)生具有重要的意義。本研究通過CT檢測分析了小型豬內(nèi)臟脂肪與全身脂肪分布，結(jié)果表明，高糖高脂飼喂引起的小型豬肥胖全身脂肪增加(P<0.05)，而內(nèi)臟脂肪增加更顯著(P<0.01),這種內(nèi)臟脂肪的增高可能是引起胰島素抵抗的重要誘因。

肥胖通常伴隨著脂代謝紊亂，血脂升高，尤其HDL-C的升高為脂代謝紊亂的標(biāo)志。血脂異常代表著體內(nèi)脂蛋白代謝異常引起的一種狀態(tài)，血脂異常所形成的脂毒性可能在胰島素抵抗的產(chǎn)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，因這種脂毒性造成的胰島素抵抗又反過來加重了脂代謝紊亂的產(chǎn)生，最終形成惡性循環(huán)[19]。周博等通過高脂飼料(蔗糖10%、豬油10%及膽固醇5%)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠8周構(gòu)建成了小鼠肥胖模型，該模型表現(xiàn)為體質(zhì)量、血糖以及血清胰島素水平均升高，結(jié)果表明高脂飲食可誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生較多的ROS，引起脂類代謝紊亂，從而產(chǎn)生胰島素抵抗。此外，脂肪組織釋放出的游離脂肪酸(FFA)通過血液循環(huán)沉積到骨骼肌及肝細(xì)胞中，能夠使蛋白激酶C(PKC)和IKK-β活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致IRS-1活性的降低、PI3K活性下降，GLUT-4表達(dá)減少，從而產(chǎn)生胰島素抵抗[20]。本實驗表明小型豬連續(xù)飼喂高糖高脂飼料，引起肥胖的同時，也存在明顯的脂代謝紊亂。此外，從腎功能指標(biāo)看，血清蛋白、尿酸、尿素均升高，尤其以尿素升高顯著(P<0.01)，推測連續(xù)30周的高糖高脂飼喂，也可引起早期的腎功能損傷。這與當(dāng)前肥胖與胰島素抵抗關(guān)系的研究成果相一致。

綜上所述，本研究通過高糖高脂飼料誘導(dǎo)法成功建立起小型豬肥胖模型，并對小型豬肥胖與胰島素抵抗之間的關(guān)系做了初步探討。肥胖發(fā)生的分子機(jī)制與其進(jìn)一步發(fā)展為2型糖尿病的情況還需進(jìn)一步研究。