闕 斐,黃涵年,趙 粼

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用工程系,浙江杭州 310018)

香蕉果肉香甜軟滑,含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖類、鉀、鎂、維生素A和C等,是人們喜愛的水果之一,它能夠促進(jìn)腸胃蠕動(dòng)、潤(rùn)腸通便[1],具有降低血清膽固醇、防治胃腸潰瘍、高血壓、憂郁癥、咳嗽和減肥等功效[2-3]。

蛋白酶和超氧化物歧化酶是酵素食品含有的主要功效酶[4],具有提高身體自愈力、促進(jìn)體內(nèi)新陳代謝、提高腸的蠕動(dòng)、抗炎抗菌、增強(qiáng)人體免疫等多種功效[5- 6],其活性在一定程度上反應(yīng)了酵素食品的品質(zhì)。目前酵素食品在日本、臺(tái)灣已經(jīng)發(fā)展為成熟產(chǎn)業(yè),形態(tài)豐富多樣的酵素類產(chǎn)品讓食用酵素成了日本人、臺(tái)灣人認(rèn)可的健康習(xí)慣[7]。但是日本、臺(tái)灣酵素因其采用的原料多以蔬菜、藥草為主,產(chǎn)品口感不佳,所以果蔬酵素的發(fā)展空間與市場(chǎng)潛力巨大。

傳統(tǒng)酵素食品在加工過程中常用的微生物有植物乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等。本文通過比較自然發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵、植物乳桿菌發(fā)酵香蕉酵素發(fā)酵過程中抗氧化活性、蛋白酶活力、超氧化物歧化酶活力以及多糖的含量在發(fā)酵過程中的不同變化,對(duì)其發(fā)酵規(guī)律進(jìn)行初步探究,以期獲得美味和營養(yǎng)兼具的新型發(fā)酵飲品,同時(shí)為香蕉酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉(產(chǎn)自厄瓜多爾) 大潤(rùn)發(fā)超市;YMC1005-B1植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) 河北一然生物科技有限公司;酵母菌 安琪葡萄酒高活性干酵母,安琪酵母股份公司;DPPH試劑、福林酚、Tris堿 Solarbio公司;無水乙醇 煙臺(tái)三和化學(xué)試劑有限公司;鄰苯三酚、酪氨酸溶液 上海源葉生物科技有限公司;苯酚 天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司;碳酸鈉 天津市巴斯夫化工有限公司;HCl 萊陽市康德化工有限公司;TCA 上海麥克林生化科技有限公司;以上試劑均為分析純。

AR1140電子分析天平 奧豪斯國際貿(mào)易有限公司;WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;QYC-200型恒溫培養(yǎng)搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;DHP-9032型電熱恒溫培養(yǎng)箱 龍口市先科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉酵素的制作工藝 香蕉去皮,切成薄片→加入黃糖→調(diào)節(jié)pH與糖度→按照3%比例接菌發(fā)酵12 d→過濾取上清液→測(cè)定指標(biāo)。

1.2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定 用無水乙醇配制0.1 mmol/L DPPH溶液,加入無水乙醇、浸提試劑(蒸餾水),再分別加入發(fā)酵后的酵素樣品(表1),混勻后于517 nm測(cè)其吸光度[8]。

表1 DPPH清除自由基能力

1.2.3 清除羥自由基活性的測(cè)定 清除羥自由基的活性判定采用鄰二氮菲-Fe2+法[9]。在一定量的待測(cè)樣液中,依次加入鄰二氮菲、硫酸亞鐵和雙氧水,混勻,37℃恒溫水浴90 min,測(cè)定536 nm 處的吸光值。具體試劑加樣量如表2。

表2 清除羥自由基活性的測(cè)定

式中:A1為鄰二氮菲與硫酸亞鐵反應(yīng)的吸光度;A2為鄰二氮菲、硫酸亞鐵和雙氧水反應(yīng)的吸光度;A3為樣品吸光度;A4為樣品與鄰二氮菲、硫酸亞鐵和雙氧水的吸光度。

1.2.4 SOD酶活測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[10]。鄰苯三酚在堿性條件下能迅速氧化,釋放出O2,生成帶色的中間產(chǎn)物,反應(yīng)開始后先變成黃綠色,幾分鐘后轉(zhuǎn)換成黃色,線性時(shí)間維持在3～4 min,加入酶液則抑制其自氧化速度,見表3,325 nm處測(cè)定溶液的吸光度,計(jì)算SOD酶活。

表3 SOD活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)

式中:A0:鄰苯三酚自氧化的吸光度;ASOD:樣品光密度值變化。

式中:V1:反應(yīng)液總體積,mL;V2:測(cè)定樣品體積,mL;n:酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.5 堿性蛋白酶活力的測(cè)定 采用Folin-酚法[11]。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取105 ℃下,完全干燥后的酪氨酸0.5 g,用0.2 moL/L HCl 250 mL溶解,配成酪氨酸溶液,分別取0、1、2、3、4、5 mL酪氨酸溶液,用0.2 moL/L HCl定容至100 mL,取1 mL酪氨酸溶液加2.5 mL碳酸鈉和0.5 mL福林試劑,混勻,37 ℃水浴30 min,測(cè)定660 nm吸光度,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.2.5.2 蛋白酶活力的測(cè)定 取2.5 mL 0.6%的酪蛋白底物,在37 ℃下水浴10 min,加入0.5 mL酵素樣品混勻,在37 ℃水浴鍋中振蕩水浴10 min,加入2.5 mL TCA試劑混勻,在37 ℃靜置水浴30 min,過濾收集1 mL濾液,加入2.5 mL Na2CO3和0.5 mL福林試劑混勻后在37 ℃水浴鍋中靜置水浴30 min,在660 nm處測(cè)定其吸光度。

蛋白酶酶活(U/g)=A×K×(11/2)×(1/10)×(1/W)

式中:A:樣品吸光度;K:相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線上吸光度為1時(shí)的酪氨酸數(shù)量,μg;W:1 mL溶液中加入的樣品克數(shù)(稀釋因子);11:反應(yīng)總體積,mL;2:反應(yīng)后收集的反應(yīng)液;10:反應(yīng)時(shí)間,min。

1.2.6 多糖含量的測(cè)定 多糖測(cè)定采用苯酚硫酸法[12]。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定的發(fā)酵液,按照體積比1∶3加入70%乙醇,靜置過夜,抽濾后獲得殘?jiān)?0%乙醇清洗3次,烘干后,用蒸餾水溶解并定容至100 mL,按照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定方法操作并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的多糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)采取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,采用Origin 9.3作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉酵素發(fā)酵過程中清除DPPH自由基能力變化

發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化如圖1所示。酵母菌、植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素DPPH自由基清除率明顯高于自然發(fā)酵的香蕉酵素。酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素樣品在約2 d時(shí)自由基清除率要高于接有植物乳桿菌的樣品,并在第3 d時(shí)被植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素超過。隨著時(shí)間的變化,植物乳桿菌發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素清除率均呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì),最高清除率可分別達(dá)到79.54%和69.79%。

圖1 香蕉酵素DPPH自由基清除能力

2.2 清除羥自由基活性的測(cè)定

如圖2,在發(fā)酵的0～12 d中羥自由基清除率隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì),酵母菌、植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素的羥自由基清除率最高分別達(dá)到49.97%和45.38%,明顯高于自然發(fā)酵過程。

圖2 發(fā)酵過程中羥自由基清除率的變化

2.3 SOD酶活力的變化趨勢(shì)

由圖3可見,在0～9 d酵母菌、植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素在發(fā)酵過程中其SOD酶活力均隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)上升趨勢(shì),從第3～9 d期間酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素SOD酶活要明顯高于植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素酶活,第9～12 d,兩者變化幅度很小,達(dá)到基本穩(wěn)定的狀態(tài),發(fā)酵后的香蕉酵素酶活力最高可分別達(dá)到89.50和86.79 U/mL,高于自然發(fā)酵過程。

圖3 香蕉酵素在發(fā)酵過程中SOD酶活力變化

2.4 蛋白酶活力的變化趨勢(shì)

2.4.1 蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以吸光度為縱坐標(biāo),以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖4所示?；貧w方程y=0.1445x+0.0382,R2=0.9964,其中x為酪氨酸濃度,y對(duì)應(yīng)吸光值。在酪氨酸濃度20～100 μg/mL范圍內(nèi)兩者具有良好的線性關(guān)系。

圖4 Folin-酚法測(cè)定堿性蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 蛋白酶活力的變化趨勢(shì) 由圖5可見,酵母菌、植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素在發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)酶活力變化趨勢(shì)基本一致,在第0～3 d酶活急劇增大,第3 d后達(dá)到緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì),第9 d后達(dá)到基本穩(wěn)定狀態(tài),最高酶活分別為67.90和66.58 U/g,皆明顯高于自然發(fā)酵過程的蛋白酶活力。酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素在發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)酶活力要略高于接有植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素,但差異不大,兩者發(fā)酵后達(dá)到基本穩(wěn)定狀態(tài)后的酶活均比最開始發(fā)酵時(shí)的酶活增加將近3倍。

圖5 香蕉酵素蛋白酶活力

2.5 多糖含量的計(jì)算

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以葡萄糖濃度x為橫坐標(biāo),吸光度y為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示,回歸方程y=0.0116x+0.18128,R2=0.99944,具有良好的線性關(guān)系。

圖6 苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 多糖含量的變化趨勢(shì) 多糖含量隨時(shí)間的變化如圖7所示,自然發(fā)酵和接有酵母菌、植物乳桿菌的香蕉酵素在0～6 d,多糖含量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中微生物產(chǎn)酶將香蕉中結(jié)合多糖充分酶解釋放出來;第6 d之后達(dá)到一定程度自然發(fā)酵的酵素多糖含量呈逐漸下降趨勢(shì),酵母菌和植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素多糖含量趨于穩(wěn)定。酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素多糖含量高于接有植物乳桿菌的酵素,最高含量可達(dá)20.45 mg/g。

圖7 香蕉酵素在發(fā)酵過程中多糖含量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以香蕉作為原料,比較了自然發(fā)酵、酵母菌發(fā)酵、植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素抗氧化活性、相關(guān)酶活及多糖含量在發(fā)酵過程中的變化。結(jié)果表明在香蕉的發(fā)酵過程中其清除自由基能力、堿性蛋白酶活力和SOD酶活力以及多糖含量都是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增強(qiáng),最后達(dá)到基本穩(wěn)定狀態(tài),其DPPH自由基最高清除率分別可達(dá)到48.97%、79.54%和69.79%;其羥自由基清除率最高可分別達(dá)37.68%,49.97%和45.38%;其SOD最高酶活力分別達(dá)到48.35、89.5和86.79 U/mL;其堿性蛋白酶的最高酶活分別為32.28、67.90和66.58 U/g;其多糖最大含量為17.31、20.45 和19.9 mg/g。對(duì)比接種酵母菌和植物乳桿菌發(fā)酵的兩組香蕉酵素,其品質(zhì)指標(biāo)差異并不顯著,但兩者都高于自然發(fā)酵組。酵母菌發(fā)酵的香蕉酵素各項(xiàng)指標(biāo)都高于植物乳桿菌發(fā)酵的香蕉酵素,但差異不明顯,說明這兩種菌均可用于接種香蕉制作酵素。