陳 宓

宮頸癌是1種高發(fā)于發(fā)展中國家女性生殖系統(tǒng)的惡性腫瘤，每年的發(fā)病率及死亡率居高不下[1]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，癌基因、早婚早育、性生活混亂、不良生活習(xí)慣及病毒感染等多種因素共同參與其中[2-3]。但根據(jù)數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，絕大多數(shù)宮頸癌患者均有高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染史，HPV已被證實(shí)是宮頸癌癌前病變及發(fā)病的獨(dú)立影響因素[4]。作為HPV中最常見的類型，HPV16和HPV18型病毒主要通過抑制抑癌基因的功能，促使細(xì)胞癌變[5]。本研究對宮頸癌組織中的人乳頭瘤病毒16、18型E6蛋白(human papillomavirus type16、18 E6，HPV16、18E6)與p53的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，并分析其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年4月至2017年7月收治的宮頸癌患者131例，年齡29～61歲，分別收集其手術(shù)切除的宮頸癌組織及癌旁正常組織作為研究組和對照組。根據(jù)TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)對131例患者進(jìn)行分期，其中Ⅰ期78例，Ⅱ期43例，Ⅲ期10例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)組織病理學(xué)檢測確診為宮頸癌；②術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療及其他腫瘤系統(tǒng)性治療；③有HPV16和HPV18型病毒感染史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；②住院資料不完整；③依從性不好，不能配合研究。本研究上報本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者對本研究中樣本收集充分知情并理解，均自愿簽署知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

中性甲醛(上海鈺博生物科技有限公司)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；EDTA抗原修復(fù)液(青島捷世康生物科技有限公司)；兔抗人HPV16、18E6單克隆抗體、鼠抗人p53多克隆抗體(上海篤瑪生物科技有限公司)；羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(上海赫澎生物科技有限公司)；DAB顯色盒(南京賽泓瑞生物科技有限公司)；蘇木素(上海寶曼生物科技有限公司)；生物組織包埋機(jī)(型號：SDSCV9000，意大利Diapath公司)；組織切片機(jī)(型號：OST 5000，美國Warner公司)；電熱恒溫水箱(蘇州凱特爾儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測宮頸癌及癌旁正常組織中HPV16、18E6與p53蛋白的表達(dá)水平。所有組織在離體1 h內(nèi)用中性甲醛固定，依次經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后用組織切片機(jī)切成連續(xù)切片，厚度約為4 μm，接著對組織切片進(jìn)行脫蠟、漂片烘干、抗原修復(fù)、過氧化物酶阻斷，山羊血清封閉后，滴加一抗兔抗人HPV16、18E6單克隆抗體和鼠抗人p53多克隆抗體，2種抗體工作濃度均為1∶100，4 ℃孵育過夜，經(jīng)PBS緩沖液3次清洗，滴加二抗羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG，37 ℃孵育15 min，用PBS緩沖液清洗3次，加入適量經(jīng)PBS緩沖液稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育10 min，PBS緩沖液清洗后，嚴(yán)格按照DAB顯色盒說明書對切片進(jìn)行顯色操作，清洗后用蘇木精復(fù)染，再清洗、脫水、制片，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行閱片。

免疫組化結(jié)果判斷：2名具有執(zhí)業(yè)資格經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在雙盲情況下進(jìn)行閱片，避開組織壞死出血及刀口區(qū)，隨機(jī)選取5個高倍視野，每個視野包含100個細(xì)胞，觀察染色程度，統(tǒng)計每個視野陽性細(xì)胞率并求平均值。將不著色、黃色、棕黃色、黃褐色分別記為0、1、2、3分；將陽性細(xì)胞率≤10%、>10%～20%、>20%～50%、>50%～80%、>80%分別記為0、1、2、3、4分。將兩項評分相乘計算免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)，當(dāng)IHS≤2分時，記為(-)，當(dāng)IHS≥3分時，記為(+)。

1.4 觀察指標(biāo)

宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6與p53的表達(dá)水平，宮頸癌組織中p53的表達(dá)水平與HPV16、18E6的關(guān)系，以及宮頸癌患者年齡、TNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及病理類型等病理臨床特征與HPV16、18E6和p53的表達(dá)水平間的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS20.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，采用卡方檢驗(yàn)對計數(shù)資料進(jìn)行分析，p53表達(dá)水平與HPV16、18E6的關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)進(jìn)行分析。P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6和p53的表達(dá)情況

HPV16、18E6主要表達(dá)于細(xì)胞核，少部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，p53表達(dá)于細(xì)胞核，免疫組化陽性染色均為棕黃色。HPV16、18E6在宮頸癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率分別為74.8%(98/131)和39.7%(52/131)，p53在宮頸癌組織及癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率分別為22.1%(29/131)和1.5%(2/131)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織及癌旁正常組織中HPV16、18E6和p53的表達(dá)情況比較(例，%)

2.2 宮頸癌組織中p53的表達(dá)水平與HPV16、18E6的關(guān)系

比較HPV16、18E6表達(dá)水平不同的宮頸癌組織中p53的表達(dá)，HPV16、18E6陽性的宮頸癌組織中p53的陰性表達(dá)率為76.5%(75/98)，宮頸癌組織中p53的表達(dá)水平與HPV16、18E6呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.58，P<0.05)。見表2。

表2 宮頸癌組織中p53與HPV16、18E6的關(guān)系/例

2.3 HPV16、18E6及p53與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

分析131例宮頸癌組織中HPV16、18E6的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，HPV16、18E6與患者年齡、組織學(xué)分級和病理分型有關(guān)(P<0.05)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P>0.05)；p53表達(dá)與患者TNM分期和組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分型情況無關(guān)(P>0.05)。見表3。

表3 HPV16、18E6及p53與各病理臨床特征的關(guān)系/例

3 討論

宮頸癌的發(fā)生是多個致病因素共同作用的結(jié)果，作為最有公認(rèn)度的宮頸癌高危因素，高危型HPV的持續(xù)感染可加速宮頸癌前病變到癌變的過程[6]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，僅有1%～10%的宮頸癌患者無HPV感染史[7]。HPV有多種類型，在宮頸癌患者中最為常見的有HPV16型及HPV18型，分別促進(jìn)宮頸鱗癌及宮頸腺癌的發(fā)生[8-9]。作為一種惡性腫瘤，宮頸癌各臨床病理特征與治療方案的選擇及疾病預(yù)后都密切相關(guān)，因此尋找與各臨床病理特征有關(guān)的指標(biāo)，對宮頸癌患者意義重大。

HPV16、18主要通過早期癌蛋白E6發(fā)揮其致癌作用，其作用機(jī)制為HPV16、18E6與p53結(jié)合，使p53功能化結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，喪失生理作用，并促使其進(jìn)入泛素依賴的降解過程[10-11]。生理情況下，細(xì)胞內(nèi)p53蛋白表達(dá)處于低水平，而當(dāng)機(jī)體受到不良刺激，DNA發(fā)生損傷時，p53蛋白水平明顯上升，起到修復(fù)損傷DNA、誘導(dǎo)DNA發(fā)生損傷且不能修復(fù)的細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期的作用，這對維持機(jī)體細(xì)胞正常增殖及保持基因組的穩(wěn)定性具有重大意義[11]。此外，p53還能與某些序列的DNA發(fā)生特異性結(jié)合，參與其他細(xì)胞周期調(diào)控基因的激活過程，抑制原癌基因表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移[12]。當(dāng)HPV16、18E6促使p53喪失正常功能并發(fā)生降解，致使DNA受損的細(xì)胞異常增殖，最終導(dǎo)致癌變[13]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中HPV16、18E6及p53的陽性表達(dá)率均高于正常宮頸組織，提示宮頸癌患者組織中HPV16、18E6及p53的表達(dá)水平呈上升趨勢。HPV16、18E6還能將自身病毒基因與宿主細(xì)胞的基因進(jìn)行整合，通過細(xì)胞增殖而不斷繁殖，使機(jī)體內(nèi)HPV16、18E6持續(xù)維持在較高水平[14]。HPV16、18E6蛋白具有特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域，這種特殊的結(jié)構(gòu)域使HPV16、18E6具有與DNA、RNA結(jié)合，抑制其他細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)蛋白作用，進(jìn)而破壞細(xì)胞正常增殖周期的功能[15]。此外，HPV16、18E6還能通過抑制端粒酶抑制因子X1的表達(dá)，上調(diào)感染細(xì)胞中端粒酶活性，致使宮頸細(xì)胞失去增殖限制發(fā)生永生化增殖，引起癌變[16]。

本研究結(jié)果還顯示，宮頸癌組織中p53的表達(dá)水平與HPV16、18E6呈負(fù)相關(guān)，且HPV16、18E6在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與患者年齡、組織學(xué)分級和病理分型有關(guān)，與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)；p53的表達(dá)水平與患者TNM分期和組織學(xué)分級有關(guān)，與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分型情況無關(guān)。

綜上所述，HPV16、18E6與p53蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平均呈上升趨勢，宮頸癌組織中p53的表達(dá)水平與HPV16、18E6呈負(fù)相關(guān)，HPV16、18E6通過誘導(dǎo)p53降解，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。此外，HPV16、18E6的表達(dá)水平與患者年齡、組織學(xué)分級和病理分型呈相關(guān)性，p53的表達(dá)水平與患者TNM分期和組織學(xué)分級呈相關(guān)性。