姚 理,馬艷芳,周漪波,竇文淵,賈雨薇,趙建亮*,應光國

氯咪巴唑在魚體的富集和代謝動力學

姚 理1,3,馬艷芳1,周漪波1,竇文淵1,賈雨薇2,趙建亮2*,應光國2

(1.中國廣州分析測試中心,廣東省化學危害應急檢測技術重點實驗室,廣東 廣州 510070；2.華南師范大學環(huán)境研究院,廣東省化學品污染與環(huán)境安全重點實驗室,廣東 廣州 510006；3.中國科學院廣州地球化學研究所,廣東 廣州 510640)

選取中國南方地區(qū)典型生物尼羅羅非魚作為受試生物,將其置于氯咪巴唑含量為2.00ng/mL的水體中暴露7d,考察氯咪巴唑在羅非魚體內不同部位(鰓、肝臟、膽汁和血漿)的吸收和清除動力學過程,比較了氯咪巴唑在魚體內不同部位的吸收和清除動力學速率.羅非魚暴露于氯咪巴唑水溶液3d后,魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的氯咪巴唑達到最高濃度,分別為2.91ng/g,33.7ng/g,4.84ng/mL和2.58ng/mL;結束暴露3d后,氯咪巴唑在鰓、膽汁和血漿中的穩(wěn)定濃度低于方法檢測限,在肝臟中的穩(wěn)定濃度為1.28ng/g.魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中氯咪巴唑的吸收動力學常數(shù)u分別為0.069,0.813,0.286和0.136h-1;清除動力學常數(shù)e分別為0.033,0.029,0.082和0.060h-1;半衰期1/2分別為21.1,23.9,8.51和11.6h.氯咪巴唑在羅非魚體內的吸收/清除動力學過程均符合偽一級動力學方程,方程的相關系數(shù)2范圍為0.75~0.98.氯咪巴唑在魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)對數(shù)值logBCFss分別為0.50,1.56,0.72和0.45,低于氯咪巴唑在野生羅非魚體內的富集系數(shù).

氯咪巴唑；吸收動力學；清除動力學；生物富集

氯咪巴唑是一種典型的唑類殺真菌劑,其主要通過非競爭性阻斷酶中羊毛甾醇14-去甲基化酶(也稱為真菌)的合成,從而抑制等離子體真菌細胞膜的重要組成部分麥角固醇的生物合成,使真菌細胞死亡[1-2].氯咪巴唑作為抑菌劑和抗頭皮屑的活性成分普遍添加到洗發(fā)水等個人護理品中[3-4].據調查,含氯咪巴唑的洗發(fā)水在中國和歐洲各國均廣泛銷售[5],氯咪巴唑在中國的年使用量為3800t[6].統(tǒng)計表明,氯咪巴唑在普通洗發(fā)水中的含量最高可達2.0%,其質量濃度大約為15mg/mL[7].洗發(fā)水使用以后,其中的氯咪巴唑大部分隨家用生活廢水進入城市污水處理系統(tǒng)[8].但是,目前各污水處理廠常用的污水處理工藝并不能將氯咪巴唑完全去除,其水相去除率僅為34%~76%[9],未被完全去除的氯咪巴唑隨污水處理廠出水重新進入受納水環(huán)境[10].

進入環(huán)境后,氯咪巴唑對各級水生生物均存在不同程度的毒性效應,其生態(tài)毒性逐漸引起關注[11-12].氯咪巴唑對綠藻()、浮萍()、大型蚤()、斑馬魚胚胎()等均存在生長或行為抑制效應,其中對綠藻的半數(shù)生長抑制效應濃度(EC50)低至0.087μg/ mL[7,11].氯咪巴唑的持續(xù)排放對水生生態(tài)系統(tǒng)構成威脅.目前有關氯咪巴唑在生物體內的含量水平及富集潛力研究較少,前期少量調查研究表明,氯咪巴唑能在珠江流域和長江流域野生魚體肌肉和肝臟中富集,最高檢出濃度可達358ng/g[13].實驗室內關于氯咪巴唑的研究主要集中在其生物毒性效應評價及微生物降解能力方面[11,14-15],缺乏氯咪巴唑在生物體內的代謝轉化機制研究.

本文研究了環(huán)境相關暴露濃度下,氯咪巴唑在我國常見生物尼羅羅非魚()鰓、肝臟、膽汁和血漿中的吸收、清除動力學過程及穩(wěn)態(tài)富集水平.旨在為氯咪巴唑的生態(tài)風險及人體健康風險評價提供理論支持,為氯咪巴唑的環(huán)境管理工作提供科學依據.

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

安捷倫1200系列高效液相色譜-6460系列三重四級桿串聯(lián)質譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS,美國安捷倫公司);MGS-2200系列平行氮吹儀(日本EYELA公司).氯咪巴唑標準品和同位素內標抑霉唑-D5從Dr.Ehrenstorfer公司(德國)購買,其純度均大于95%.色譜純甲醇、乙腈、二甲基亞砜從Merck公司(德國)購買.分析純肝素鈉、三卡因甲基磺酸鹽、乙酸、乙酸鈉、乙酸銨和甲酸從CNW公司(德國)購買.Captiva蛋白質/磷脂吸附管、QuEChERS鹽析試劑盒(無水乙酸鈉+無水硫酸鎂)和分散固相萃取試劑盒(無水硫酸鎂+-丙基乙二胺PAS+C18)從Agilent公司(美國)購買,實驗用水為超純水.

1.2 實驗設計

表1 暴露組溶液水質參數(shù)及氯咪巴唑的濃度

注:0為實驗過程中,每天換水后5min內測量值;24h為實驗過程中,每天換水后24h測量值; n.d.表示未檢出.

選取5個月齡左右的尼羅羅非魚()作為受試生物.從南方某漁業(yè)公司獲得受試生物后,曝氣運回實驗室,置于100L干凈的塑料桶中馴養(yǎng)至少4周,然后用于暴露試驗.馴養(yǎng)過程中,每天投放個體質量1.0%的基礎營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)受試生物,觀察并記錄進食情況、死亡率、異常行為、魚膚色等指標.結束馴養(yǎng)后,選擇進食正常,狀態(tài)活潑的羅非魚用于暴露實驗,研究魚體內氯咪巴唑的吸收和清除動力學過程.暴露容器為180L的透明玻璃魚缸,暴露溶液為預曝氣脫氯的純凈水,暴露溶液體積為150L,每缸投放羅非魚數(shù)量為25條.吸收和清除動力學試驗周期為14d,分為7d吸收期和7d清除期.試驗周期內持續(xù)適量曝氧,溫度控制在(26±1)℃,光暗周期保持為14h:10h.投食后,每隔12h清理一次缸內糞便以保持水質清潔,實驗過程中記錄的相關水質參數(shù)如表1所示.

表2 代謝動力學試驗所用魚樣品信息

注: 肝重和鰓重表示用于提取的樣品重量.

7d吸收期實驗中,氯咪巴唑的理論暴露濃度設為2.00ng/mL,暴露開始的0h時刻,取2條未染藥的羅非魚作為初始時刻樣品.然后,將600μL濃度為500μg/mL的氯咪巴唑標準溶液(溶劑為二甲基亞砜DMSO)溶于1L潔凈的超純水中,充分溶解后,緩慢均勻加入150L魚缸中開始暴露.以后的6d吸收期實驗中,每24h換水75L,再補加300μL濃度為500μg/mL的氯咪巴唑標準溶液(溶于1L干凈純凈水),直至7d吸收期結束.7d吸收期實驗結束后,將魚缸內的受試生物全部轉移到不含氯咪巴唑的150L干凈水體中,開始7d清除期試驗,7d清除期內,每24h換水75L.在14d的吸收動力學和清除動力學試驗過程中,于試驗過程中的第1,3,5,7,8,10,12和14d取樣2條(2個平行),立即通過三卡因甲基磺酸鹽進行麻醉,稱重,量體長,并盡快解剖取組織,所用樣品基本信息如表2所示.

1.3 樣品前處理和儀器分析

前處理:根據前期建立的組織提取方法,鰓和肝臟采用QuEChERS方法提取[16];膽汁和血漿采用溶劑沉淀,并通過吸附管去除蛋白質/磷脂質,其中,膽汁通過分散固相萃取進一步凈化[17].取一份鰓或肝臟樣品,依次加入40ng內標,5mL超純水和兩顆陶瓷勻漿子渦旋30s.然后加入10mL乙腈(含1%乙酸)和鹽析試劑,立即用手劇烈搖晃1min.3500r/min離心10min后,取7mL上層有機相采用分散固相萃取試劑進行凈化.3500r/min離心10min后,取5mL凈化液通過氮氣吹至近干,采用200μL甲醇/水(:=1:1)溶液定容.取50μL血漿或50μL膽汁,依次加入40ng內標和500μL乙腈(含1%乙酸),渦旋混合30s.將混合液加入Captiva蛋白質/磷脂吸附管,加載壓力25~50kPa過濾,收集濾液.繼續(xù)加入200μL乙腈(含1%乙酸)潤洗管壁,收集并合并濾液.隨后,血漿濾液直接通過氮氣吹至近干,采用200μL甲醇/水(:=1:1)溶液定容;膽汁濾液加入乙腈(含1%乙酸)稀釋至6mL,隨后采用分散固相萃取試劑凈化.3500r/min離心10min,取3mL凈化液通過氮氣吹至近干,采用200μL甲醇/水(:=1:1)溶液定容.水體中的氯咪巴唑萃取過程:取2mL暴露水溶液,依次采用3mL正己烷溶液萃取3次,合并萃取液,通過氮氣吹至近干,采用200μL甲醇/水(:=1:1)溶液定容.

儀器分析:生物提取液和水溶液中的氯咪巴唑采用UPLC-MS/MS在電噴霧離子源正離子模式下進行分析,利用安捷倫SB-C18柱(3.0×100mm,1.8μm)進行液相色譜分離,進樣體積5μL,流動相為含0.05%甲酸和5mmol/L乙酸銨的水溶液(A)和甲醇(B),梯度洗脫程序為: 0min時刻50% B;5min時刻80% B;6.5min時刻90% B,并保持5min,分析單個樣品總時長11.5min.流動相流速0.3mL/min,色譜柱溫度保持40℃.離子源參數(shù)為:毛細管電壓4500V,噴霧電壓500V,噴霧氣體溫度250℃,氯咪巴唑在多反應離子監(jiān)測模式(MRM)下的碎裂電壓為115V,定量離子對為293.1>69.1,對應的離子碰撞能量為20eV,定性離子對為293.1>41.1,對應的離子碰撞能量為44eV.

1.4 質量控制與保證

生物提取液和水溶液中氯咪巴唑的濃度通過內標法進行定性和定量分析,采用抑霉唑-D5作為同位素標記內標.配制目標物氯咪巴唑濃度分別為0.1ng/mL,0.5ng/mL,1ng/mL,2ng/mL,5ng/mL,10ng/mL,20ng/mL,50ng/mL,100ng/mL,內標抑霉唑-D5濃度均為20ng/mL的標準曲線溶液,標準曲線相關系數(shù)2大于0.998.每批樣品分析過程中均同時設置空白加標、程序空白和溶劑空白,用于評價儀器狀態(tài)并檢查攜帶污染和背景空白.空白加標中氯咪巴唑的回收率為86%~113%.采用前期建立的提取方法,氯咪巴唑在魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的最低檢測限MQLs分別為0.3,1.16,0.8和0.76ng/g.數(shù)據分析過程中,通過保留時間偏差￡5%,離子比例偏差￡20%作為定性分析的依據.

1.5 數(shù)據分析

1.5.1 動力學參數(shù) 采用Sigma plot軟件,以吸收期、清除期的采樣時間點為橫坐標,以各采樣時間點氯咪巴唑在魚體內不同部位的濃度為縱坐標作圖,得到魚體內不同部位中氯咪巴唑的濃度隨實驗時刻的變化曲線.根據經典的偽一級動力學模型對曲線進行擬合[18],獲得魚體內不同部位對氯咪巴唑的吸收、清除動力學方程.根據動力學方程的相關系數(shù),計算得到氯咪巴唑在魚體內不同部位的吸收動力學常數(shù)u、清除動力學常數(shù)e和清除半衰期1/2[19-20].其中,u、e和1/2分別通過以下公式進行計算:

式中:w為暴露水體中氯咪巴唑的濃度,單位為ng/mL;c和0分別為時刻和清除期實驗開始時氯咪巴唑在魚體內不同部位中的濃度: 鰓、肝臟中氯咪巴唑的濃度單位為ng/g,膽汁、血漿中氯咪巴唑的濃度單位為ng/mL;為暴露時間,h;u和e單位為h-1;1/2為氯咪巴唑在魚體內不同部位的半衰期,h.

1.5.2 生物富集系數(shù) 采用OECD推薦的計算方法[21],根據氯咪巴唑在魚體內的吸收和清除動力學方程,可以計算獲得氯咪巴唑在魚體內的動力學生物富集系數(shù)BCFK和穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)BCFss,其中BCFK和BCFss分別通過以下公式進行計算:

式中:u和e為根據式(1)~(3)計算得到的氯咪巴唑在魚體內的吸收動力學常數(shù)和清除動力學常數(shù), h-1;f為氯咪巴唑在魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的穩(wěn)定濃度,ng/g或ng/mL;w為氯咪巴唑在暴露水體中的實測穩(wěn)定濃度,ng/mL.

氯咪巴唑在魚體內不同部位的濃度數(shù)據采用安捷倫Muss Hunter軟件進行采集和計算,數(shù)據結果采用Excel軟件進行分析.動力學方程參數(shù)采用Sigma Plot軟件進行非線性曲線擬合,通過判定系數(shù)2來評價動力學模型的擬合優(yōu)度.動力學曲線圖采用Origin軟件進行繪制.

2 結果與討論

2.1 氯咪巴唑的吸收動力學特征

如圖1所示,吸收期的第72h(即第3d),氯咪巴唑在魚體內中的濃度達到最大值;吸收期的第72h~168h暴露結束(即第7d),氯咪巴唑在魚體內的濃度保持穩(wěn)定.氯咪巴唑在鰓和肝臟、膽汁和血漿中的穩(wěn)定濃度分別為2.91和33.7ng/g、4.84和2.58ng/mL.根據曲線非線性擬合結果,氯咪巴唑在魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的吸收動力學過程均符合偽一級動力學方程,方程擬合結果的相關系數(shù)2分別為0.75,0.83,0.90和0.96.氯咪巴唑在羅非魚體內的吸收動力學方程如表3所示,通過方程參數(shù)可以獲得氯咪巴唑在羅非魚鰓、肝臟、膽汁和血漿中的吸收動力學常數(shù)u分別為0.069,0.813, 0.286和0.136h-1.比較可知:氯咪巴唑在肝臟中u最高,相比鰓中的u高一個數(shù)量級,相比膽汁和血漿分別高2倍和5倍,說明相比其他部位,羅非魚肝臟更容易吸收氯咪巴唑.前期研究指出,水體中羥基安定、美索巴莫、四溴雙酚A在魚體肝臟中的濃度和吸收速率也高于腦、膽汁、鰓、肌肉等部位,這可能是由于肝臟作為解毒器官,更容易吸收外源性污染物[20,22].

2.2 氯咪巴唑的清除動力學特征

如圖1所示,清除期的第72h(即第3d),氯咪巴唑在魚體內中的濃度達到最低值;清除期的第72h~ 168h實驗結束(即第7d),氯咪巴唑在魚體內的濃度保持穩(wěn)定.氯咪巴唑在鰓、肝臟、膽汁和血漿中的穩(wěn)定濃度分別為0.10ng/g (

表3 氯咪巴唑的吸收和清除動力學擬合方程

與氯咪巴唑不同的是,羥基安定和美索巴莫在魚體肝臟中的1/2分別為18.1和47.5h;羥基安定和美索巴莫在魚體膽汁中的1/2分別為72.2和84.5h,魚體肝臟代謝是羥基安定和美索巴莫的主要代謝途徑[20].說明外源性小分子污染物在魚體內的代謝機制存在差異,這可能與污染物本身的性質有關,有待進一步研究.

2.3 氯咪巴唑的魚體富集規(guī)律

根據OECD推薦的方法,計算獲得氯咪巴唑在羅非魚鰓、肝臟、膽汁和血漿中的動力學生物富集系數(shù)對數(shù)值logBCFK分別為0.32,1.45,0.54和0.36;根據表1中氯咪巴唑在暴露水體中的濃度,計算獲得7d吸收動力學實驗過程中,氯咪巴唑在暴露水體中的平均濃度為0.92ng/mL.從而計算獲得氯咪巴唑在羅非魚鰓、肝臟、膽汁和血漿中的穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)對數(shù)值logBCFss分別為0.50,1.56,0.72和0.45.氯咪巴唑在魚體鰓、肝臟、膽汁和血漿中的動力學生物富集系數(shù)logBCFK和穩(wěn)態(tài)生物富集系數(shù)logBCFss比較接近.說明7d吸收動力學實驗過程中,氯咪巴唑在魚體內已經達到吸收/清除動力學平衡[21].比較可知,氯咪巴唑在肝臟中的生物富集水平較高,在鰓和血漿中的生物富集水平較低.根據前期的調查結果,氯咪巴唑在長江、珠江流域野生羅非魚肝臟中的生物富集系數(shù)對數(shù)值logBAF平均值為2.42[13].比較而言,實驗室暴露條件下氯咪巴唑在羅非魚體內的生物富集水平低于野外暴露添加下羅非魚體內的生物富集水平.這可能是由于氯咪巴唑在地表水、藻類中均存在污染[24],野生魚類分別通過捕食低等水生動植物被動攝取,以及鰓呼吸主動吸收這兩種途徑,同時從食物和地表水中攝入氯咪巴唑[25].由于氯咪巴唑不斷排入受納環(huán)境,導致氯咪巴唑在環(huán)境中持續(xù)存在,并不斷被野生魚類攝入,而生物體對污染物的清除速率有限,導致氯咪巴唑在魚體內不斷累積,最終導致野外調查獲得的logBAF高于實驗室單一水體暴露時魚體內氯咪巴唑的logBCFss.

3 結論

3.1 氯咪巴唑在羅非魚鰓、肝臟、膽汁和血漿4種組織中的吸收和清除動力學過程均符合偽一級動力學方程.魚體肝臟吸收氯咪巴唑的速率遠高于鰓,膽汁的肝腸循環(huán)是氯咪巴唑的重要代謝途徑.

3.2 羅非魚在濃度為2ng/mL的氯咪巴唑水體中暴露3d后,氯咪巴唑在各組織部位的穩(wěn)定濃度順序為肝臟>膽汁>鰓、血漿.結束暴露3d后,氯咪巴唑在鰓、膽汁和血漿中的穩(wěn)定濃度已

3.3 氯咪巴唑在魚體內不同部位的富集能力存在差異,較易在肝臟中富集,在鰓和血漿中的富集水平較低.實驗室暴露條件下氯咪巴唑在羅非魚體內的生物富集水平低于野外暴露添加下羅非魚體內的生物富集水平.

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YAO Li1,3, MA Yan-fang1, ZHOU Yi-bo1, DOU Wen-yuan1, JIA Yu-wei2, ZHAO Jian-liang2*, YING Guang-guo2

(1.Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemical, China National Analytical Center (Guangzhou), Guangzhou 510070, China；2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Chemical Pollution and Environmental Safety, the Environmental Research Institute, South China Normal University, Guangzhou 510006, China；3.Guangzhou Institute of Geochemistry, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640, China)., 2019,39(8)：3501~3507

We used a typical fish species in South China, tilapia, to investigate the uptake and elimination kinetics of climbazole in fish gill, liver, bile and plasma following a 7-d exposure to aqueous solution of climbazole at the concentration of 2.00ng/mL. We also compared the uptake and elimination rates of climbazole in fish tissues. In the uptake process, the climbazole concentration reached the maximum after 3days of exposure, at which point the concentration in fish gill, liver, bile and plasma were up to 2.91ng/g, 33.7ng/g, 4.84ng/mL and 2.58ng/mL, respectively. In the elimination process, the climbazole was nearly eliminated in fish after 3days, with the climbazole concentrations lower than MQLs in fish gill, bile and plasma, and of 1.21ng/g in fish liver. The uptake kinetic constants (u) of climbazole in fish gill, liver, bile and plasma were 0.069, 0.813, 0.286 and 0.136h-1, respectively; while the corresponding elimination kinetic constants (e) were 0.033, 0.029, 0.082 and 0.060h-1, respectively. The half-time values of climbazole in fish gill, liver, bile and plasma were 21.1, 23.9, 8.51 and 11.6h, respectively. The uptake and elimination processes of climbazole in fish tissues followed the pseudo first-order kinetic model, with the correlation coefficients2in the range of 0.75~0.98. The log bioconcentration factor of climbazole at steady state in fish gill, liver, bile and plasma were 0.50, 1.56, 0.72 and 0.45, respectively, which were lower than those in wild tilapia fish.

climbazole；uptake kinetics；elimination kinetics；bioaccumulation

X503.22

A

1000-6923(2019)08-3501-07

姚 理(1990-),女,湖南益陽人,助理研究員,博士,主要從事新型污染物的生物富集及代謝轉化研究.發(fā)表論文10余篇.

2019-01-15

廣東省科學院發(fā)展專項資金資助項目(2019GDASYL- 0103022);國家自然科學基金資助項目(41877360)

* 責任作者, 研究員, jianliang.zhao@m.scnu.edu.cn