于肖肖，李丹丹，高基民

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

膀胱癌是全世界第9種常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是第13種最常見(jiàn)的癌癥死亡原因[1-2]。監(jiān)測(cè)膀胱癌治療效果需要合適的動(dòng)物模型，傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)技術(shù)需要將動(dòng)物處死，而近十幾年來(lái)得到快速發(fā)展的小動(dòng)物活體成像技術(shù)解決了這個(gè)問(wèn)題。生物發(fā)光成像技術(shù)(BLI)是一種非侵入性的實(shí)時(shí)可視化成像模型，可以在細(xì)胞、分子或基因水平上檢測(cè)生物體內(nèi)的生理或病理變化[3]。納米載藥體系近幾年來(lái)發(fā)展迅速，納米材料可以包載小分子物質(zhì)靶向運(yùn)送至腫瘤部位，提高治療效果[4-5]。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的膀胱癌細(xì)胞MB49細(xì)胞系，構(gòu)建了小鼠膀胱癌皮下模型，用明膠包裹的單壁碳納米管作為納米載藥體系，包載鼠粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(mGM-CSF)和阿霉素(DOX)，通過(guò)小鼠眼眶靜脈進(jìn)行治療，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行近紅外光照射治療，以期達(dá)到光熱、免疫、化療聯(lián)合治療的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

MB49細(xì)胞是小鼠膀胱癌細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院。

1.1.2 試劑

1640培養(yǎng)基、胎牛血清、嘌呤霉素，美國(guó)Gibco公司；青霉素、鏈霉素溶液，中國(guó)碧云天公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠和BALB/C裸鼠購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心，雌性，6～8周齡，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，獨(dú)立送風(fēng)柜中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質(zhì)粒的構(gòu)建

選擇實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP為模板，設(shè)計(jì)PCR引物(F：5-CGAGAC TAGTTCTAGGCCACCATGGAAGATGC-3，R：5-TTG CGGCCGTCTAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3)，由上海桑尼公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：98 ℃變性10 s；60 ℃退火15 s，68 ℃延伸2.5 min，共30個(gè)循環(huán)。通過(guò)膠回收得到Luc2GFP片段，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ對(duì)載體質(zhì)粒pLVX-EF1a-IRES-Puro進(jìn)行酶切，得到線性的質(zhì)粒pLVX-EF1a-IRES-Puro，和Luc2GFP進(jìn)行無(wú)縫克隆，用trans 5ɑ進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定，取鑒定符合預(yù)期的克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的膀胱癌MB49-Luc細(xì)胞的構(gòu)建

利用實(shí)驗(yàn)室的慢病毒包裝平臺(tái)，對(duì)pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到慢病毒，利用慢病毒感染MB49細(xì)胞，用2 μg·mL-1嘌呤霉素進(jìn)行篩選，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)單細(xì)胞分選技術(shù)得到單個(gè)MB49-Luc細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡來(lái)篩選出能夠表達(dá)熒光素酶和綠色熒光蛋白的細(xì)胞，用于后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2.3 小鼠膀胱癌正位模型的構(gòu)建

BALB/C雌性裸鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉150 μL，待小鼠呼吸平穩(wěn)后，將小鼠放于無(wú)菌紙墊料上，用酒精棉球?qū)π∈笸饽虻揽谔庍M(jìn)行消毒。將液體石蠟中浸泡過(guò)的一次性靜脈留置針軟管沿著小鼠尿道外口插入膀胱，用PBS沖洗3次，注入100 μL配制好的0.1 mol·L-1HCl，待留置20 s后，吸出50 μL棄掉，迅速注入50 μL 0.1 mol·L-1NaOH并留置5 s，然后全部吸出，用PBS沖洗3次，排空膀胱，注入100 μL 0.2×106MB49-Luc細(xì)胞，然后留置于膀胱2 h。

1.2.4 納米載藥體系治療小鼠

將6～8周齡C57BL/6雌性裸鼠皮下注射2×106MB49-Luc細(xì)胞，7 d后小鼠皮下成瘤。將小鼠分為4組，每組5只，分別為PBS組、Gel@SWCNTs-DOX組、Gel@SWCNTs-GMCSF組、Gel@SWCNTs-DOX-GMCSF組。對(duì)小鼠腫瘤內(nèi)注射100 μL治療材料，30 min后NIR(1 W·cm-2)照射腫瘤2 min治療，4 d后活體成像監(jiān)測(cè)腫瘤治療效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒PcDNA3.1-FLAG-Luc2GFP為模板，PCR擴(kuò)增出Luc2GFP片段(圖1)。

圖1 Luc2GFP基因凝膠電泳的結(jié)果

將載體質(zhì)粒pLVX-EF1a-IRES-Puro用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切后，切膠回收，與PCR得到的Luc2GFP基因片段進(jìn)行無(wú)縫克隆。將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入trans 5ɑ，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和NotⅠ進(jìn)行酶切鑒定，得到2個(gè)大小為8.9 ku和2.4 ku的片段，說(shuō)明成功構(gòu)建了pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質(zhì)粒(圖2)。

圖2 pLVX-EF1a-Luc2GFP-IRES-Puro質(zhì)粒酶切的結(jié)果

2.2 穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的膀胱癌MB49-Luc細(xì)胞的構(gòu)建

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到MB49-Luc細(xì)胞中Luc和GFP的表達(dá)達(dá)到93.8(圖3)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組細(xì)胞中Luc和GFP均有表達(dá)(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果

圖4 Western blot檢測(cè)的結(jié)果

2.3 小鼠膀胱癌正位模型的構(gòu)建

通過(guò)留置針將MB49-Luc細(xì)胞注入6～8周的BALB/C雌性裸鼠膀胱內(nèi)，分別在第11天和第20天觀察，結(jié)果顯示，小鼠膀胱癌正位模型構(gòu)建成功(圖5)。

圖5 小鼠膀胱癌正位模型的活體成像

2.4 納米載藥體系對(duì)小鼠的治療效果

如圖6所示，與對(duì)照組PBS相比，各處理對(duì)小鼠腫瘤均有一定的治療效果。

圖6 不同處理組小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況

3 討論

納米材料種類繁多，如脂質(zhì)體、碳納米管、聚合物納米粒子、聚合物膠束、固體脂質(zhì)納米粒、囊泡、樹(shù)枝狀聚合物及硅、金、銀等金屬納米粒子[6]。納米載體的粒徑一般為1～1 000 nm[7]，其中單臂碳納米管因其自身的特性被廣泛關(guān)注[8-9]，同時(shí)也有高度疏水性和細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)[10-11]，實(shí)際使用中可利用明膠來(lái)修飾單臂碳納米管，降低其疏水性和細(xì)胞毒性[12-13]。

粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是具有二硫鍵的酸性糖蛋白[14]，可以刺激產(chǎn)生大量造血和非造血細(xì)胞，激活和引發(fā)髓樣細(xì)胞群產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，具有促炎細(xì)胞因子的作用[15-17]。阿霉素(doxorubicin，DOX)是一種蒽環(huán)類化合物，用于治療血液惡性腫瘤、軟組織肉瘤等多種癌癥，且對(duì)實(shí)體瘤具有顯著活性[18]。利用明膠修飾的單臂碳納米管來(lái)包載GM-CSF，DOX對(duì)小鼠膀胱癌進(jìn)行治療，同時(shí)利用近紅外光進(jìn)行光熱治療，促進(jìn)納米載藥體系包載物質(zhì)的釋放，提高腫瘤部位藥物濃度，并利用活體成像對(duì)治療效果進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，納米載藥體系對(duì)小鼠膀胱癌有一定的治療效果，為后續(xù)膀胱癌的治療研究提供參考。