張利平，黃振東，蒲占胥，鹿連明

(浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州 318026)

柑橘黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)上毀滅性的病害，由韌皮部難養(yǎng)桿狀菌引起，病原菌有亞洲種(CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas)、非洲種(Ca.L.africanus，CLaf)和美洲種(Ca.L.americanus，CLam)3個(gè)種，通過(guò)嫁接和木虱傳播[1-5]；由于病原菌的侵入導(dǎo)致柑橘微觀組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，感病葉片氣孔凹陷萎縮，氣孔周圍組織變得粗糙不平整，柵欄組織細(xì)胞排列疏松、有較大的間隙；病株果蒂細(xì)胞變的大小不均勻，部分細(xì)胞皺褶扭曲變形，細(xì)胞間隙變大，果蒂的部分維管束堵塞[6]；由于病原菌的侵入導(dǎo)致柑橘代謝發(fā)生變化，甜橙染病后，地上部出現(xiàn)淀粉積累，地下部分則發(fā)生淀粉欠缺[7]，長(zhǎng)鏈脂肪酸POA、OA、ALA、ARA降低[8]，同時(shí)植株激素也有變化，花后7和12個(gè)月的病果產(chǎn)生的乙烯減少，但在有癥狀果實(shí)花柱端、中部或莖端果皮中，IAA和ABA含量比無(wú)癥狀感病果實(shí)和正常果實(shí)高[9]，因此植株在感染病菌后，微觀結(jié)構(gòu)及微生態(tài)環(huán)境都有所改變。

植物內(nèi)生真菌是全部生活史或者部分生活史在植物組織內(nèi)且不會(huì)對(duì)植株造成不良影響的真菌。內(nèi)生真菌與植物存在一個(gè)平衡點(diǎn)，一旦平衡被打破，內(nèi)生真菌與植物的共生關(guān)系就會(huì)被打破[10]，植物體內(nèi)的內(nèi)生真菌種群有可能發(fā)生變化。本文以溫州蜜柑為研究對(duì)象，研究了感染黃龍病柑橘植株的內(nèi)生真菌的多樣性及與健康植株的差異，旨在為黃龍病的防治及病理研究提供一定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將有關(guān)試驗(yàn)結(jié)果總結(jié)和報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

溫州蜜柑黃龍病植株和健康植株均采自柑橘所橘園內(nèi)，樹(shù)齡均為20 a，采集結(jié)紅鼻子果的橘樹(shù)病株，健康植株是秋季結(jié)正常果實(shí)，且經(jīng)過(guò)定量PCR鑒定為黃龍病菌為陰性的植株。分別采集病株和健康植株5株樹(shù)，每株樹(shù)上東南西北中5個(gè)方位采集葉片10片。

1.2 樣品消毒分離與保存

采集的葉片自來(lái)水沖洗干凈后，撕取葉片中脈，先在75%酒精中浸泡45 s，3%次氯酸鈉溶液中浸泡3～5 min，然后75%酒精中浸泡45 s，無(wú)菌水沖洗5～6次，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌剪刀將葉片中脈剪成1 cm左右的小段，置于PDA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)1周后出現(xiàn)菌落，切取菌落邊緣純化，經(jīng)過(guò)多次純化后得到純的菌落，純的菌落斜面保存于4 ℃冰箱。

1.3 真菌分子鑒定

1.3.1 DNA提取

刮取菌落表面菌絲于液氮中研磨，研磨后將100 mg粉末裝于1.5 mL離心管中，利用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit試劑盒(Protocol-II)取真菌DNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

引物為ITS1/ITS4/ITS5通用引物(序列為5-′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)；擴(kuò)增體系是50 uL，包括PremixTaq(EX)酶25 μL、10 μm引物1，3 μL、10 μm引物2，3 μL滅菌水17 μL，真菌DNA 2 μL，設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照是清水做模板，陽(yáng)性對(duì)照是已知真菌DNA。擴(kuò)增程序依次是：95 ℃ 3 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物直接送測(cè)序公司純化測(cè)序，測(cè)序公司分別是賽默飛蘇州測(cè)序部和寶生物大連生物工程有限公司，測(cè)序的儀器是ABI3730，測(cè)序?yàn)殡p向測(cè)序，得到的序列利用DNASTAR 7.1 Seqman拼接校對(duì)，校對(duì)后的序列在Blast比對(duì)，根據(jù)相似度確定種屬，序列均提交到NCBI上。登錄號(hào)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，病株共分離到內(nèi)生真菌21株，經(jīng)鑒定隸屬于11個(gè)屬，其中炭疽菌屬有9株，是優(yōu)勢(shì)菌群；輪層炭殼菌屬和鏈隔孢屬分別有2株，其他屬均1株。健康植株共分離到內(nèi)生真菌35株，經(jīng)鑒定屬于18個(gè)屬，其中炭疽菌屬有7株，光黑殼屬和黑孢霉屬分別有4株，炭角菌屬和枝孢霉屬分別有3株，小從殼屬有2株，其他屬均1株，感病植株的內(nèi)生真菌數(shù)量和種類均少于健康植株，病株和健株都有炭疽菌屬，且均為優(yōu)勢(shì)菌群，都有鏈隔孢屬、半殼孢屬(Leptostromasp.)和葉點(diǎn)霉屬(Phyllostictacapitalensis)，病株有2株鏈隔孢屬，健株有1株。

表1 柑橘健康植株和病株內(nèi)生真菌比較

3 討論

內(nèi)生真菌與寄主是互惠共生的關(guān)系，有些內(nèi)生真菌可以促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收，有些可以提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力，有些內(nèi)生真菌可刺激植物產(chǎn)生活性物質(zhì)等[10]。柑橘植株感染黃龍病后在基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平、代謝水平及顯微結(jié)構(gòu)上發(fā)生了一系列變化，淀粉在帶病成熟葉中大量積累，基因DPE2和MEX1被下調(diào)表達(dá)，這兩個(gè)基因與淀粉分解代謝相關(guān)，蛋白表達(dá)也有差異，幾丁質(zhì)酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和4個(gè)miraculin類似蛋白在感病甜橙葉片樣品中表達(dá)提高3.6～13.7倍[11]；柑橘體內(nèi)的內(nèi)生真菌當(dāng)植株感染黃龍病后對(duì)植株有什么影響，是變成了致病菌還是在幫助植株對(duì)抗黃龍病菌，植物啟動(dòng)的應(yīng)答反應(yīng)是不是也有內(nèi)生真菌參與其中，這些有待于進(jìn)一步研究。