郝峰鴿，李桂榮，王保全，蔡祖國(guó)，尤 楊，牛生洋

（河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

【研究意義】植物根癌病又稱冠癭病，是由根癌土壤桿菌屬（Agrobacterium spp.）中的致病菌所引起的一種世界性病害。病原菌侵染后，感病植株會(huì)在根、莖甚至枝條上形成大小不一的癭瘤，不但影響植株對(duì)水分和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和運(yùn)輸，同時(shí)還使其他病原微生物更易侵染，導(dǎo)致樹(shù)勢(shì)衰弱，易感病，果實(shí)品質(zhì)及產(chǎn)量下降，甚至造成植株死亡?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】早期人們根據(jù)寄主范圍和病害癥狀將土壤桿菌屬分為根癌土壤桿菌、發(fā)根土壤桿菌、懸鉤子土壤桿菌及放射形土壤桿菌，認(rèn)為除放射形土壤桿菌無(wú)致病性外其余3種菌都能引起發(fā)病。進(jìn)一步研究認(rèn)為，土壤桿菌的病害癥狀是由質(zhì)粒類型決定的，而非細(xì)菌的種類，因而這種以可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒引發(fā)的致病性作為分類依據(jù)并不科學(xué)。后來(lái)，人們又以生理生化特征和致病性特征，將土壤桿菌屬直接劃分為生物Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3個(gè)生物型［1-2］。

帶有染色體外的、環(huán)狀閉合的Ti（tumor-inducing plasmid）質(zhì)粒是致病的土壤桿菌的共同特征，其上有T-DNA (transfer-DNA)區(qū)、Vir區(qū)及冠癭堿分解代謝區(qū)與致病過(guò)程有關(guān)。根癌土壤桿菌可侵染雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物等多種植物，包括重要的經(jīng)濟(jì)作物，尤其以果樹(shù)中的核果類、漿果類、仁果類和堅(jiān)果類易感?。?-4］。桃根癌病是由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的土壤病害，在我國(guó)桃栽培區(qū)的發(fā)病率最高達(dá)到90%［3］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根癌病菌是土壤習(xí)居菌，具有潛伏侵染和系統(tǒng)侵染性，再加之苗木生產(chǎn)和調(diào)運(yùn)中缺乏檢疫措施，更加劇了該病害的傳播和蔓延［3,5］。

前人對(duì)桃根癌病病原菌的研究認(rèn)為，不同根癌病病原菌對(duì)同一寄主的致病性是不同的［6-7］?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本試驗(yàn)對(duì)從不同地區(qū)桃根瘤組織中分離，經(jīng)初步鑒定的根癌病病原菌進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，了解病原菌的類型及其致病力，為今后桃根癌病的抗病育種工作及生物防治打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桃根癌病病原菌及其來(lái)源

從我國(guó)不同桃產(chǎn)區(qū)包括北京平谷、河北昌黎、河北石家莊、山東泰安、江蘇南京、甘肅蘭州等采集桃樹(shù)根癌病組織，分離根癌病病原菌，并經(jīng)初步形態(tài)學(xué)和致病性分子檢測(cè)。

1.2 植物材料

指示植物：向日葵（市售）種子浸泡10 h后，置26 ℃培養(yǎng)箱中保濕催芽，萌發(fā)后播種于腐葉土∶蛭石∶園土=1∶1∶2的混合基質(zhì)中培養(yǎng)。

中桃抗砧1號(hào)、報(bào)春、紅根甘肅桃×貝蕾F1、毛桃等4個(gè)品種/單株6～10年生植株。中桃抗砧1號(hào)自花授粉實(shí)生苗（3年生）。

1.3 病原菌的分離、純化與保存

將完整癭瘤組織沖洗干凈，去除老化表皮，從不同方位選取幼嫩白色的瘤組織2～3塊（約2.0 g），75%酒精處理1 min，無(wú)菌水沖洗3次；切成2 mm×2 mm的小塊，加入1～2 mL蒸餾水，用滅菌玻棒搗碎，在2 mL無(wú)菌離心管中浸泡30 min，取100 μL浸泡液涂布于D1M培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～4 d。挑取具有根癌土壤桿菌特征的單菌落，劃線純化培養(yǎng)，然后挑取單菌落于液體YEB培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)約 16 h［8］。

YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌液直接放4℃可保存2個(gè)月。將菌液與30%的滅菌甘油1∶1混勻，液氮速凍后于-80℃長(zhǎng)期保存。

1.4 桃根癌病病原菌鑒定

1.4.1 病原菌致病性的分子鑒定 參照Haas等［9］的方法，對(duì)根癌土壤桿菌與T-DNA轉(zhuǎn)移和癭瘤形成相關(guān)的virD2和ipt基因分別進(jìn)行檢測(cè)。virD2基因的引物virD2A：5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′；virD2C：5′-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3′，目的條帶203 bp。ipt基因引物CYT：5′-GATCG(G/C)GTCCAATG(C/T)TGT-3′；CYT：5′-GATATCCATC GATC(T/C)CTT-3′，目的片段427 bp。

PCR反應(yīng)體系：50 ng模板DNA（新鮮菌液），1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，0.5 U Ex Taq DNA酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以重蒸水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s、55℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.2 病原菌致病性的生物學(xué)鑒定 （1）3-酮苷試驗(yàn)：將分離純化后的菌株接種于YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)約16 h。培養(yǎng)好的菌液在5 000 r/min條件下離心10 min，用滅菌蒸餾水重懸，并調(diào)整濃度為1×109CFU/mL。在含有1%乳糖、0.1%酵母浸膏和2%瓊脂的培養(yǎng)基上，接種待測(cè)菌，28 ℃培養(yǎng)1～2 d。經(jīng)培養(yǎng)后在平板上倒一薄層Benedict試劑，靜置于室溫下。如果產(chǎn)生3-酮基乳糖，在菌落的周圍出現(xiàn)Cu2O的黃圈，約1 h后黃圈達(dá)最大，出現(xiàn)該現(xiàn)象則為生物Ⅰ型。

（2）向日葵接種鑒定：待苗高至5～10 cm時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯、整齊一致的向日葵苗接種。在苗子下胚軸接近子葉的部位，用解剖刀劃1 cm長(zhǎng)的傷口，在傷口處涂抹一滴菌液（約20 μL），然后用封口膜包裹保濕。每個(gè)菌株接種10棵苗。同時(shí)接種無(wú)菌水作對(duì)照。接種后的幼苗放置于28 ℃溫室培養(yǎng)。從接種后5 d開(kāi)始，每天定時(shí)觀察發(fā)病情況。

（3）桃枝條接種鑒定：接種參照Bliss等［10］的方法。在中桃抗砧1號(hào)、報(bào)春、紅根甘肅桃×貝蕾F1等3個(gè)品種/單株上，選生長(zhǎng)較直立，健壯的新梢，從距枝條頂端10 cm的位置，用解剖刀劃1 cm長(zhǎng)的傷口，深及木質(zhì)部，在傷口處涂抹一滴菌液（約20 μL），然后用封口膜包裹保濕，每株菌每個(gè)植株上接種3個(gè)枝條，每個(gè)枝條接種5個(gè)位點(diǎn)，位點(diǎn)間間隔約5 cm，同時(shí)接種無(wú)菌水作對(duì)照。單株區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置4個(gè)區(qū)組。接種后40 d調(diào)查，以瘤直徑衡量病原菌的致病力。

1.4.3 病原菌16S rDNA序列測(cè)定 對(duì)經(jīng)致病性表現(xiàn)最強(qiáng)的3個(gè)菌株進(jìn)一步進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，以確保試驗(yàn)材料的準(zhǔn)確性。引物采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492r：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′［11］。

細(xì)菌基因組DNA提?。喝【?.5 mL，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入0.5 mL蒸餾水，混勻，煮沸10 min，然后用CTAB法提取DNA。

PCR反應(yīng)體系：80 ng模板DNA，1×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.0 U Ex Taq DNA 酶，上下游引物各0.5 μmol/L，以無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足20 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性40 s、54 ℃退火40 s、72℃延伸40 s，4個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將1 500 bp的目的片段用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（Biomed）回收目的片斷，連接至pMD 19-T載體（TaKaRa），并轉(zhuǎn)化導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選。陽(yáng)性克隆送往上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性分子檢測(cè)

virD2基因參與病原菌侵染寄主的過(guò)程，ipt基因是造成寄主植物病癥的關(guān)鍵基因之一［9,12-13］，而virD2與ipt基因結(jié)合能從不同角度反映病原菌的致病性。兩對(duì)特異引物在21株病原菌中均出現(xiàn)203 bp和427 bp的目的片段（圖1）。說(shuō)明從不同桃產(chǎn)區(qū)分離的根癌農(nóng)桿菌菌株基本都有致病性，這也是桃樹(shù)會(huì)有大面積發(fā)病的原因。

2.2 病原菌的生理生化鑒定

盡管所分離的菌株都有致病性，但分清楚致病菌的生物型，對(duì)深入研究其發(fā)病機(jī)制有重要作用。對(duì)21個(gè)經(jīng)初步鑒定具有致病性的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果表明，致病菌中主要是生物Ⅱ型，有18株，其余3株菌為生物Ⅰ型（圖2）。

2.3 病原菌對(duì)指示植物向日葵幼苗的致病性

指示植物接種與分子鑒定相比，需時(shí)較長(zhǎng)，但能更客觀地反映病原菌的致病性。為了驗(yàn)證不同菌株的致病能力，將鑒定為生物Ⅱ型的菌株接種在指示植物向日葵上，結(jié)果（圖3）表明，21株病原菌均能使向日葵幼苗長(zhǎng)瘤，但瘤的大小有差異，即不同菌株對(duì)向日葵幼苗的致病能力存在差異。

圖2 3-酮苷反應(yīng)鑒定12株病原菌的生物型Fig.2 Biotypes of 12 strains from peach crown galls identified by 3-Ketolactose test

圖3 不同菌株對(duì)向日葵幼苗的致病性Fig.3 Virulence of several isolated strains on sunflower seedlings

2.4 病原菌對(duì)桃樹(shù)枝條的致病性

由于指示植物和目標(biāo)植物在抗病性及對(duì)病原菌的應(yīng)答機(jī)制有所不同，在指示植物上有強(qiáng)致病力的菌株還需要在桃樹(shù)進(jìn)行最終驗(yàn)證。選擇對(duì)向日葵幼苗致病力強(qiáng)的10株菌，接種在不同種桃樹(shù)枝條上，比較其對(duì)桃樹(shù)的致病力。結(jié)果（圖4）表明，不同植株形成的瘤大小有差異，即不同菌株之間的致病力強(qiáng)弱存在差異，其中菌株AT4-3（生物Ⅱ型）的致病力最強(qiáng)。

圖4 AT4-3菌株在桃樹(shù)及近緣種上的致病情況Fig.4 Pathogenic status of strain AT4-3 on peach trees and other relative species

2.5 病原菌16S rDNA測(cè)序鑒定

將包括AT4-3在內(nèi)的3個(gè)菌株的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，與根癌土壤桿菌相似性均在99%以上（表1），由此可確定這3個(gè)菌株均為根癌土壤桿菌。

表1 AT4-3菌株16S rDNA測(cè)序結(jié)果同源性比對(duì)Table 1 Homologous alignment of strain AT4-3 16S rDNA sequencing results

3 討論

根癌土壤桿菌中的生物Ⅰ型和生物Ⅱ型是桃及其他核果類的致病菌［2,7-8］。LI等［14］從采自我國(guó)5個(gè)地區(qū)的桃根瘤組織分離的19株根癌土壤桿菌中，鑒定出生物Ⅱ型14株，說(shuō)明生物Ⅱ型為優(yōu)勢(shì)菌群。在同一條件下的桃抗根癌病評(píng)價(jià)中，生物Ⅱ型致病力強(qiáng)于生物Ⅰ型［15-17］。本試驗(yàn)篩選出的強(qiáng)致病力菌為生物Ⅱ型，這與前人的研究結(jié)果一致。

在根癌土壤桿菌致病性鑒定時(shí)，分子檢測(cè)因其快速、簡(jiǎn)便，得到廣泛的研究及應(yīng)用［9,14,18-19］。分子檢測(cè)方法大多根據(jù)根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒的Vir區(qū)和T-DNA區(qū)保守序列設(shè)計(jì)特異引物，其中Vir區(qū)與病原菌附著、T-DNA加工和轉(zhuǎn)移相關(guān)，T-DNA區(qū)為致瘤區(qū)，二者在決定病原菌的致病性時(shí)缺一不可。因此，在致病性鑒定時(shí)，至少需要Vir區(qū)與T-DNA區(qū)各一對(duì)引物相結(jié)合才能確定病原菌的致病性。即使這樣，分子檢測(cè)方法還是有其局限性，比如Vir區(qū)，存在大約35個(gè)vir基因［12-13］，而一對(duì)引物也只能反映出某一個(gè)vir基因的存在與否（根據(jù)基因區(qū)間序列設(shè)計(jì)的引物除外），因此可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另外，在經(jīng)向日葵接種鑒定表現(xiàn)為致病性的菌株，在桃上卻仍沒(méi)有表現(xiàn)出病狀。這可能是因?yàn)橹甘局参锊皇窃摬≡淖匀患闹鳎荒芡耆煽康胤从吃摬≡鷮?duì)桃的致病能力［20］。

4 結(jié)論

本研究對(duì)來(lái)源于其他實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所）的21株病原菌進(jìn)行鑒定，為后繼的試驗(yàn)提供可靠的材料。生理生化鑒定認(rèn)為，其中的3株菌為生物Ⅰ型，18株菌為生物Ⅱ型；分子生物學(xué)和生物學(xué)方法（接種指示植物向日葵）鑒定表明21株菌均具有致病性，但存在致病能力的差異。選擇對(duì)向日葵致病力最強(qiáng)的10株菌接種桃枝條，發(fā)現(xiàn)致病力也有差異。最后，對(duì)在桃上致病力表現(xiàn)最強(qiáng)的3株菌進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，確定其為根癌土壤桿菌，以其中致病性最強(qiáng)的AT4-3作為后繼試驗(yàn)的致病菌。