郝婧瑋，索蓮宦，楊斯棋，陳思宇，梅念念，季宇彬

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076； 2.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

柑橘屬蕓香科柑橘亞科包括柑、橘、橙、檸檬等品種。柑橘果皮主要由外果皮、中果皮、內(nèi)果皮組成，柑橘皮油胞中含豐富的香精油，約為果皮鮮重的0.5%～2%。精油是采用各種方法在植物的根、莖、葉、花、果皮或果實(shí)中提取的具有易揮發(fā)性的一類油狀液體，能產(chǎn)生濃郁的香味和氣味、可以隨水蒸氣蒸餾出來的油狀物質(zhì)。又稱芳香油、香精油(essential oils)、揮發(fā)油(volatile oils)[1]。精油具有許多活性成分，例如有酯類、醇類、芳香烴類和酚類萜烯烴類等。精油的揮發(fā)性很強(qiáng)，通常需要密封遮光儲存。植物精油在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域方面：去痛、消炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、保健、提高免疫力得到廣泛的運(yùn)用，活性成分可祛痰止咳[2]、祛風(fēng)健胃、驅(qū)蟲[3]、防皺保養(yǎng)。并且植物精油在化妝品，醫(yī)藥和食品加工等領(lǐng)域也存在廣泛的應(yīng)用價值[4-5]。目前常用的果皮精油提取方法有冷壓法、水蒸汽蒸餾法、微波輔助法、超臨界二氧化碳萃取法和溶劑浸提技術(shù)等[6]。水蒸餾法是一種傳統(tǒng)提取方法。它的原理是水分能向皮渣細(xì)胞組織滲入，置換芳香精油，在水蒸氣操作條件下產(chǎn)生油和水的共沸物，這個過程也存在3種不同的作用原理，分別是擴(kuò)散、水解和熱解[7]。其優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備簡單、成本低、容易操作出油率高可達(dá)1.3%～2.0%[8]。

所提精油可應(yīng)用到多個方面如護(hù)膚用品、食品、煙草等[9]。其中橙皮具有抗氧化、平喘、改善高血壓、緩解緊張情緒、改善失眠癥狀等功效[10]，同時還具有抗真菌成分，可以有效抑制黃曲霉的生長、清除自由基[11]。關(guān)于橙皮的菌性，近年來有很大進(jìn)展，橙皮精油可以的抑制黑曲霉和黃曲霉的生長[12-13]，且這種影響隨著濃度的增大而加強(qiáng)。橙皮及橘皮精油含有醇類，酮類，不飽和脂肪酸等物質(zhì)成分有良好的抗氧化性能。對果皮精油的抗氧化性能討論研究，可以進(jìn)一步擴(kuò)大桔皮的應(yīng)用領(lǐng)域，對果皮加以高值化綜合利用與開發(fā)。最近研究表明，精油及其主要成分在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面或減小實(shí)體瘤大小方面非常有效，其作用機(jī)制是精油作為氧化劑使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。精油具有很強(qiáng)的非基因水平的細(xì)胞毒性，具有抗癌作用，因此激發(fā)人們從精油中尋找天然抗癌藥物，抗腫瘤精油的篩選無疑成為研究的主要環(huán)節(jié)[14]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮橘皮、鮮橙皮；細(xì)胞株：HepG-2細(xì)胞，上海斯信生物科技有限公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：Corning公司；胎牛血清：賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司；胰蛋白酶-EDTA培養(yǎng)液：源葉生物；100×青霉素-鏈霉素溶液：biosharp；溴化四唑藍(lán)MTT(AR)、二甲基亞砜DMSO(AR)：Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基：Gibco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

微型高速粉碎機(jī)：上海賽山粉體機(jī)械制造有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號DHG-9055A):上海一恒科學(xué)技術(shù)有限公司；智能冰箱(型號BCD-206TASJX)：青島海爾股份有限公司；電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；電子控溫加熱套：金壇市榮華儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(型號UFJ-7200型)：上海尤尼科儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機(jī)(型號ALLEGRA-64RCentrifuge)：美國貝克曼公司；生物安全柜(型號BHC-1300IIA2)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；顯微鏡(型號OLYMPUS IX70)：南京瞭望光電技術(shù)有限公司；全自動酶標(biāo)儀(型號Thermo Multiskan MK3)：美國Thermo公司；超凈工作臺(型號DL-CT2N)：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精油提取

果實(shí)洗干凈，剝皮，80℃烘干至恒重，粉碎成細(xì)粉。將稱取好的40 g粉碎后的橙皮和桔皮，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入400 g蒸餾水浸泡6 h，料液比1∶10。以索式提取器為主要儀器連接好裝置，加熱回流4 h，用吸量管吸取表面油層，稱量重量，重復(fù)提取至不再有精油蒸出。如下列公示計(jì)算精油得率。

精油得率(%)=精油質(zhì)量(g)/樣品質(zhì)量(g)×100%

1.3.2 精油抑菌實(shí)驗(yàn)研究

精油濃度配制采用二倍稀釋法[14]，用無菌移液槍吸取3 mL橘皮精油和3 mL丙酮溶液放入滅菌的塑料管內(nèi)，配制濃度為50%的橘皮精油溶液，混合均勻后，取3 mL混合溶液加入另一個無菌塑料管內(nèi)，再加入3 mL丙酮溶液，混合均勻，重復(fù)上述步驟，以此制得濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(V/V%)的橘皮精油溶液。以丙酮溶液為空白作對照試驗(yàn)。

橙皮精油溶液配制與橘皮精油溶液配制方法相同。

吸取0.1 mL配制好的菌懸液，加入固體培養(yǎng)基上，將菌懸液涂抹均勻，制成帶菌平板，將皿平分三等份，每份放入一6 mm濾紙片，吸取0.03 mL精油溶液于濾紙片上，另有一平板分為兩等份，加入0.78%精油和丙酮溶液。橘皮、橙皮精油操作相同。標(biāo)記好相應(yīng)濃度后，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用直尺測量抑菌圈直徑，得到指示菌抑菌效果。比較精油對幾種菌的抑菌效果。

采用二倍稀釋法時仍以丙酮溶液[15]為溶劑，按上述方法將橘皮精油和橙皮精油配制成濃度依次為 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(V/V%)的精油溶液。將加熱的及配制好的精油倒入培養(yǎng)基中，使二者均勻混合，最后使培養(yǎng)皿中精油濃度分別為 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78(μL/mL)。將培養(yǎng)皿放置冷卻后，接種細(xì)菌，將含菌平板放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37℃，培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，與對照組(菌落正常生長)進(jìn)行比較，肉眼即可辨別生長良好的則無抑制作用，以菌落生長完全受到抑制的最低精油濃度作為最低抑菌濃度(MIC)，用丙酮溶液作為對照分別測得橘皮精油和橙皮精油對幾種指示菌的MIC。

將上述沒有菌落生長的培養(yǎng)皿繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37℃，24 h后取出，以沒有菌落生長的最低濃度作為作為精油的最低殺菌濃度(MBC)，仍以丙酮溶液作為對照。分別測得橘皮精油和橙皮精油對幾種指示菌的MBC。

1.3.3 精油抗氧化實(shí)驗(yàn)研究

DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)醇溶液顯鮮艷紫色，在517 nm處有最大吸收值，DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，被測樣品給出的氫原子與DPPH自由基結(jié)合，最大吸收波長517 nm處吸光值有所下降，并且下降趨勢呈線性關(guān)系，吸光度水平的降低表示抗氧化性增大，以測定試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。精密稱量DPPH 0.256 1 g，無水乙醇試劑定容到1 000 mL，濃度約6.5×104mol/L搖晃均勻，避光保存，用前稀釋10倍。精油對DPPH清除作用：取3支具塞試管，分別標(biāo)記1、2、3.2 mL DPPH溶液和2 mL 10%的精油溶液(精油溶于無水乙醇配好)，置于具塞試管中，作為A1。取2 mL DPPH溶液和2 mL無水乙醇溶液，加入到具塞試管中，作為A2。取2 mL兩種不同精油溶液和2 mL無水乙醇溶液，加入具塞試管里，作為A3。將三支具塞試管中溶液搖勻，放入黑暗條件反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，于最大吸收波長517 nm處分別測量吸光度值。為證明精油抗氧化能力強(qiáng)，取同體積同濃度的維生素E代替精油形成對比。操作條件相同。

清除率%=[1-(A1-A3)/A2]×100%

A1：DPPH溶液與兩種不同精油的混合溶液的吸光度值。A2：DPPH溶液和無水乙醇溶液的混合溶液的吸光值。A3：兩種不同精油和無水乙醇溶液的混合溶液的吸光值。利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基：H2O2+Fe2+→·OH + H2O+Fe3+，在反應(yīng)溶液中加入水楊酸，F(xiàn)enton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可與水楊酸反應(yīng)，生成在510 nm處有吸收的物質(zhì)2，3-二羥基苯甲酸。選擇固定反應(yīng)時間法，于波長510 nm測量含有被測樣品反應(yīng)液的吸光度值，并和空白液對比，以確定受試樣品羥自由基的清除能力。比色管中依次加9 mmol/L FeSO4，9 mmmol/L乙醇-水楊酸，加入適量的無水乙醇，加入8.8 mmol/L H2O2后搖晃均勻，37 ℃水浴環(huán)境加熱20 min之后取出，測量吸光度值A(chǔ)0。如上述方法，加入各溶液體系，來測定吸光度A1，A2羥自由，基清除率(%)=[A0-(A1-A2)/A0]×100%，其中 A0為空白對比的吸光值，A1為加樣品的吸光度值，A2為不加顯色劑H2O2的吸光度值。

1.3.4 精油抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究

將對數(shù)生長期細(xì)胞在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，用含10%新生小牛血清培養(yǎng)液配制細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)為每孔體積為100 μL含有細(xì)胞數(shù)約為104個。將96孔板放置于37℃和5% CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～12 h，直至其貼壁。每孔加入用PBS配制的梯度質(zhì)量濃度的精油20 μL，按以下順序：0.2 mg/mL，2 mg/mL，20 mg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)44 h。每孔加入20 μL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。向每個孔中加入150 μL DMSO，搖晃并震蕩10 min以充分溶解甲瓚結(jié)晶物，顯示藍(lán)紫色。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm，用空白校正，測定各孔的吸光度A，計(jì)算抑制率。

抑制率=(對照組平均吸光度值-加藥組平均吸光度值)/對照組平均吸光度值×100%

按上述方法操作，在96孔板上，將橙皮精油和橘皮精油藥物組分別按濃度梯度為0.2 mg/mL，2 mg/mL，20 mg/mL從左至右，從上至下依次加入，對照組(即只加細(xì)胞不加藥物)也如此，并于加MTT前取樣鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種精油抑菌效果

橘皮精油對三種指示菌都有一定的抑菌能力，但對金黃色葡萄球菌的抑菌能力最強(qiáng)，濃度比為50(V/V%)時抑菌直徑可達(dá)到17.6 mm。對枯草芽孢桿菌的抑菌能力次之，濃度比為50(V/V%)時抑菌直徑可達(dá)到16.4 mm。而對變形桿菌的抑菌能力最弱，濃度比為50(V/V%)時抑菌直徑只可達(dá)到11.4 mm(見圖1)。

圖1 不同濃度橘皮精油對三種指示菌的抑菌直徑

由圖2可知橙皮精油對變形桿菌的抑菌能力較差，濃度為50(V/V%)時抑菌直徑為13.4 mm，對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力強(qiáng)于變形桿菌，50(V/V%)時枯草桿菌的抑菌直徑為15.4 mm，而金黃葡萄球菌的抑菌直徑為16.4 mm。

圖2 不同濃度橙皮精油對三種指示菌的抑菌直徑

圖3 精油原油及抗生素對對三種指示菌的抑菌直徑

由圖3可看出橘皮精油和橙皮精油對上述菌種均有抑制作用，二者對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，對枯草芽孢桿菌效果次之，對變形桿菌作用最弱。頭孢氨芐對變形桿菌的抑制作用最強(qiáng)，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌次之。

通過不同濃度橘皮精油及橙皮精油對金黃色葡萄球菌的作用，得出橘皮精油及橙皮精油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度(見表1)。

表1 橘皮精油及橙皮精油對金黃色葡萄球菌最低抑菌 濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)

2.2 兩種精油抗氧化效果

由圖4可以得出橘皮精油對DPPH清除率為33.8%，橙皮精油對DPPH清除率為41.0%，維生素E對DPPH清除率為25.1%。維生素E清除率較橘皮和橙皮精油低，證明橘皮和橙皮精油有較好清除率，較高抗氧化能力。

圖4 三種物質(zhì)DPPH清除率對比柱形圖

羥自由基具有超強(qiáng)的氧化能力，能破壞活體組織中的蛋白質(zhì)、核酸、糖類等大分子而引起氧化性破壞。Vc具有很強(qiáng)的還原能力，可與(OH-)發(fā)生氧化還原反應(yīng)降低對機(jī)體的危害。同時，橘皮、橙皮精油中的萜烯類成分含有不飽和鍵，亦可對(OH-)氧化而對其起到一定清除作用，由圖 5可知相同濃度波長517 nm下的桔皮精油和橙皮精油對羥自由基的清除率分別為62.3%，54.1%。維生素E對羥自由基的清除率是14.1%。維生素E對羥自由基清除率沒有橘皮、橙皮精油高，證明橘皮、橙皮精油有較強(qiáng)抗氧化能力。

圖5 三種物質(zhì)對羥自由基清除率對比柱形圖

2.3 兩種精油抗腫瘤活性鑒定

從圖6可看出，橙皮精油抗腫瘤的效果較橘皮精油的較優(yōu)，橘皮與橙皮精油均具有很強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞的活性，精油濃度差異對肝癌細(xì)胞的抑制率變化并不十分明顯。

圖6 不同濃度精油對HepG-2肝癌細(xì)胞的抑制率

3 討論

隨著科技的進(jìn)步和人類的健康意識加強(qiáng)，人們更加傾向于自然且對人體傷害更小的商品添加劑。而精油恰好能滿足人們的要求，植物精油由植物本身提取，是植物的次生代謝產(chǎn)物，因?yàn)榫哂幸志钚?、抗氧化性、來源廣泛等特點(diǎn)，深受人們喜愛。如柑橘類精油，占鮮質(zhì)量0.5%～2.0%[15]，主要源于自身外果皮細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)可以解決工業(yè)生產(chǎn)中廢棄果皮的處理方式，如果善加利用廢棄果皮的處理方式，不僅可以減小環(huán)境壓力也可以減少資源的浪費(fèi)，將會得到環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的雙重效益[16]。因柑橘精油對食品中腐敗菌和病原菌有較好的抑制作用，可用于食品行業(yè)[17]。減少防腐劑的大量使用，增加食品的安全性。

在DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)樣品給出的氫原子和DPPH自由基結(jié)合，最大吸收波長517 nm處的吸光值有所下降，下降趨勢呈線性關(guān)系，吸光度水平的下降代表抗氧化活性增強(qiáng)，從而測試試驗(yàn)樣品的抗氧化能力。對羥自由基的清除作用包括揮發(fā)性精油植物源提取物，其既可作用自由基氧化過程中反應(yīng)鏈之前的非鏈過程，也可清除啟動鏈反應(yīng)中的OH-，清除鏈并延伸自由基，發(fā)揮預(yù)防型斷鏈型抗氧化的雙重作用，從而阻礙或清除自由基的生成。桔皮橙皮精油中的萜烯類化合物含有雙鍵，可加成(OH-)形成二級基團(tuán)，由此清除體系中大部分(OH-)，達(dá)到抗氧化目的。精油發(fā)揮抗氧化性主要是其富含的酚類成分，可清除自由基，并與金屬離子螯合，抑制細(xì)胞膜質(zhì)氧化和調(diào)節(jié)抗氧化酶發(fā)揮作用，具有一定程度的抗氧化能力。

橘皮與橙皮精油中的檸檬烯含量豐富。檸檬烯也成為苧烯，單萜類化合物，無顏色的油狀液體，其味道與檸檬相似。具有良好的化痰鎮(zhèn)咳、抗菌作用，復(fù)方檸檬烯可臨床用于溶石、利膽、排除腸內(nèi)積氣和促進(jìn)消化液分泌。在化學(xué)水平上，精油對免疫系統(tǒng)有積極作用，其提高了白細(xì)胞的活性，用于除去體內(nèi)的細(xì)菌和異物，使它們更有效。精油主要成分的活性很可能受到其他次要分子調(diào)節(jié)的。橙皮精油抑制腫瘤細(xì)胞的效果比橘皮精油好些，可能是因?yàn)槌绕ぶ械臋幟氏┖枯^橘皮中的多。