陳平安，黃家望，廖燦，袁娉，謝希，陳俊煒，程莉娟*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208； 3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

不可分型流感嗜血桿菌(non-typeable haemophilus influenzae,NTHi)是一種無莢膜的革蘭陰性桿菌，容易引起非侵襲性感染，造成成人及幼兒肺炎、腦膜炎、中耳炎[1]。它通過寄居于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，躲避機(jī)體對其實施的細(xì)胞免疫[2]。 NTHi會在宿主抵抗力下降時大量繁殖，釋放細(xì)菌產(chǎn)物，引起炎性細(xì)胞因子的釋放和炎性細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。目前國內(nèi)外還沒有可以預(yù)防NTHi感染的疫苗問世，研究NTHi的防治機(jī)制仍然十分重要[3-4]。本研究利用小鼠構(gòu)建NTHi急性肺部感染模型，小柴胡湯為治療藥物，探討小柴胡湯對炎性細(xì)胞因子白介素-1β(Interleukin -1β,IL -1β)、白 介 素-6(Interleukin -6,IL-6)、 腫 瘤 壞 死 因 子 -α(Tumor Necrosis factor-α,TNF-α)和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)表達(dá)水平的影響，小鼠肺組織損傷和炎癥的改善程度，為小柴胡湯臨床治療NTHi誘導(dǎo)的肺部炎癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器

精密分析天平(瑞士Mettler公司AE240)，臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo)，醫(yī)用凈化工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠YJ-875A)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo)，超微量分光光度計(德國IMPLEN)，微量移液器(德國eppendorf)，HH-W三用恒溫水浴箱(金壇市大地自動化儀器廠)，DHP-81恒溫箱(上海醫(yī)用儀器廠)，石蠟切片機(jī)(美國A0820)，超純水儀(millipore公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國bio-tek，Synergy2)。

1.1.2 主要試劑

小鼠IL-1β(Abcam，ab100704)，IL-6(Abcam，ab100712)，G-CSF(Abcam，ab197743)，TNF-α(Abcam，ab100747)ELISIA檢測試劑盒。

1.1.3 實驗菌株

用哥倫比亞巧克力血瓊脂平板在37℃，5%CO2的環(huán)境下傳代培養(yǎng)NTHi 12h，無菌生理鹽水重懸細(xì)菌，無菌甘油調(diào)至20%終濃度，-80℃保存[5]。

1.1.4 實驗動物

6～8周C57小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心代購。

1.1.5 實驗藥品

藥物購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。氨芐西林，聯(lián)邦制藥，0.5 g/片，批號：70910804，用雙蒸水配置成0.011 g/mL作為陽性對照藥物。小柴胡湯的主要成分為柴胡24 g，黃芩9 g，姜半夏9 g，生姜6 g，黨參9 g，甘草9 g，大棗4枚。將上述7味中藥，以8倍量蒸餾水浸泡30 min，加熱保持微沸30 min，過濾；殘渣加6倍量蒸餾水，微沸30 min，過濾，合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至138.8 mL，配成濃度為0.562 g/mL，4℃冰箱保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 NTHi感染小鼠肺炎模型建立

將40只C57小鼠正常飼養(yǎng)2～3天，采用隨機(jī)數(shù)字表法編號，隨機(jī)抽取10只作為正常對照組，其余30只小鼠作為實驗組。通過預(yù)實驗篩選出2×105CFU/肺為小鼠感染的造模劑量。照參考文獻(xiàn)[6]方法制備瓊脂珠包裹的NTHi瓊脂珠懸液，對實驗組小鼠進(jìn)行滴鼻造模，互相感染24h，正常組給予等量滅菌生理鹽水滴鼻干預(yù)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將實驗組的30只小鼠分為模型組、氨芐西林陽性對照組、小柴胡湯組，每組10只，分籠飼養(yǎng)，自由飲水取食，并與正常組小鼠分房間飼養(yǎng)。

1.2.2 給藥

正常組和模型組小鼠給予0.4 mL/(20 g·d)灌胃生理鹽水，各藥物組給予0.4 mL/(20 g·d)灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥7 d。動物給藥劑量按動物每公斤體質(zhì)量占人體表面積的比值計算[7]。

1.2.3 分離血清

最后一次給藥結(jié)束后，小鼠禁水禁食8 h，眼眶取血，滅菌1.5 mLEP管收集血液， 4℃靜置2 h，2 500 rpm離心10 min，小心吸取出上層血清，-20℃保存。

1.2.4 檢測小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)及免疫器官指數(shù)

記錄造模和給藥期間各組小鼠的體質(zhì)量。最后一次給藥結(jié)束后，禁水禁食8 h，斷頸處死小鼠，取出肺組織、胸腺和脾臟，稱重并記錄。稱重后的肺組織取左肺用4%的多聚甲醛溶液固定，常溫保存，右肺于-80℃保存。臟器指數(shù)按如下公式進(jìn)行計算[8]。

脾指數(shù)(mg/g)=脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)

胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g)

肺指數(shù)(mg/g)=肺臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)

1.2.5 HE染色觀察小鼠肺組織病理變化

取4%多聚甲醛固定的左肺、梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、間斷連續(xù)5 μm厚切片，HE染色、脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.6 ELISA法檢測小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF表達(dá)水平

按照說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每個標(biāo)準(zhǔn)樣本和實驗樣本做3個復(fù)孔，向孔內(nèi)加入生物素標(biāo)記和酶標(biāo)抗體，37℃孵育60 min，洗滌拍干重復(fù)5次后，先后加入顯色劑A和顯色劑B各50 μL，37℃避光顯色10 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，放入酶標(biāo)儀中用450 nm波長測量各孔吸光度(OD)值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，算出樣品濃度，分析它們在小鼠血清中的表達(dá)水平。

1.2.7 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠狀態(tài)

正常組小鼠精神狀態(tài)良好，活動能力強(qiáng)，毛發(fā)順滑，皮膚緊致，抓取時反抗強(qiáng)烈。模型組小鼠精神萎靡，不好動，毛發(fā)豎起，皮膚松弛，經(jīng)常蜷縮在一起，飲食量少。各藥物組小鼠的狀態(tài)較模型組小鼠有不同程度地緩解。

2.2 體質(zhì)量變化

實驗前均衡好各組小鼠的體質(zhì)量，使其符合NTHi造模的要求(P>0.05)。NTHi感染小鼠后，模型組小鼠的體質(zhì)量下降明顯，與正常組比較，差異顯著(P<0.01)。藥物組小鼠的體質(zhì)量均有不同程度地增加，與模型組比較，有顯著差異(P<0.05)。各組比較結(jié)果見表1。

表1 藥物對小鼠體質(zhì)量變化的影響

注：與正常組同期比較，**P<0.01；與模型組同期比較，△P<0.05

2.3 臟器指數(shù)分析

模型組小鼠肺指數(shù)明顯增加，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)降低，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組小鼠肺指數(shù)均有不同程度地下降(P<0.05)，胸腺指數(shù)和脾指數(shù)也有一定程度地升高，但無統(tǒng)計學(xué)差異。各組比較結(jié)果見表2。

表2 藥物對小鼠臟器指數(shù)的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

2.4 肺組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較

模型組小鼠血清中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF的表達(dá)水平明顯增加，與正常組比較有顯著差異(P<0.01)。藥物組小鼠血清中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)水平均有不同程度地下降(P<0.05)。結(jié)果見表3。

2.5 HE染色光鏡觀察

正常組:小鼠肺支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺內(nèi)未見炎癥細(xì)胞浸潤;模型組:肺組織纖維化嚴(yán)重,肺泡壁增厚加重,炎性細(xì)胞浸潤增多;氨芐西林組:肺組織纖維化減輕,肺泡開始擴(kuò)張,肺間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤,肺組織損傷程度較模型組明顯減輕;小柴胡湯組:肺組織纖維化減輕,肺泡開始擴(kuò)張,呈修復(fù)趨勢,肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤,肺組織損傷程度較氨芐西林組無明顯差異,較模型組有所減輕。各藥物組均能不同程度地改善肺組織纖維化及炎癥滲出現(xiàn)象。結(jié)果見表4與圖1。

表3 藥物對炎性細(xì)胞因子表達(dá)含量的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05

圖1 各組小鼠肺組織HE染色光鏡觀察(200×)

表4 各組小鼠肺組織病變程度

注：與模型組比較，△P<0.05

3 討論

NTHi是一種無莢膜的革蘭陰性桿菌，其釋放的細(xì)菌產(chǎn)物如內(nèi)毒素、纖毛毒素和蛋白水解酶等，容易導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放和炎性細(xì)胞在呼吸管道和肺部組織聚集，誘發(fā)巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒。NTHi感染后，白介素(Interleukin,IL)-8、IL-6、和TNF-α的分泌會大量增加，細(xì)胞間黏附因子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)含量上升，從而引發(fā)炎癥，導(dǎo)致肺組織纖維化和肺泡壁增厚加重[9]。本研究肺組織切片顯示，模型組小鼠肺組織纖維化明顯，肺泡壁增厚加重，炎性細(xì)胞浸潤增多，而小柴胡湯組小鼠的肺組織纖維化及炎癥滲出現(xiàn)象得到了一定程度地改善。

NTHi感染誘發(fā)的炎癥反應(yīng)主要是由IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的[10]。IL-1β來源于周圍和中樞神經(jīng)細(xì)胞，是一種重要的炎性因子，可誘導(dǎo)IL-8、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1等多種炎性因子的產(chǎn)生及釋放[11]。IL-6 作為促炎因子，對炎癥反應(yīng)具有促進(jìn)和放大的作用。同時，組織細(xì)胞受損的程度可以通過測量IL-6的含量得到有效的反映，因此臨床上常用它來診斷急慢性炎癥[12]。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用[13]。G-CSF是一種糖蛋白，主要通過TNF-α、內(nèi)毒素和干擾素-γ可活化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，它能刺激粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞成熟，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞系增殖和分化[14]，臨床上可用G-SCF治療由感染引起的中性粒細(xì)胞減少癥。因此，本研究選取IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF為研究靶點，探討了它們在藥物干預(yù)前后NTHi感染小鼠血清中的表達(dá)水平，旨在為臨床治療NTHi感染提供新的治療方案。

小柴胡湯出自《傷寒論》，由柴胡、黃芩、黨參、甘草、半夏、生姜、大棗七味藥組成。實驗研究證實[15]，小柴胡湯可以降低脂多糖誘導(dǎo)大鼠發(fā)熱模型的體溫，并且解熱效果明顯?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[16]，柴胡中的柴胡皂苷可抑制炎性介質(zhì)如IL-1β、IL-6、TNF-α的釋放，又能抑制白細(xì)胞向炎癥組織聚集，還能改善炎癥組織增生現(xiàn)象。Zhang等研究表明[17]，黃芩中的黃芩苷能通過降低TNF-α mRNA的表達(dá)水平，從而減少炎性細(xì)胞因子的釋放。另有研究發(fā)現(xiàn)[18]，黃芩素可以通過抑制NF-κB通路的活化，從而降低IL-1β、IL-6和IL-8等炎性細(xì)胞因子的釋放。本研究臟器指數(shù)結(jié)果顯示，小柴胡湯能夠增加小鼠的脾和胸腺指數(shù)，從而提高小鼠的免疫力，達(dá)到治療肺炎的目的[19-20]。炎性細(xì)胞因子比較結(jié)果顯示，小柴胡湯組炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF較模型組表達(dá)水平明顯降低，表明小柴胡湯對以上炎性細(xì)胞因子的分泌具有抑制作用，從而緩解炎性反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過抑制NK-κB通路的激活來降低炎性細(xì)胞因子的釋放，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[21]。

綜上所述，本研究結(jié)果提示小柴胡湯可通過抑制炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和G-CSF的分泌來緩解NTHi誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥損傷和炎癥程度，為小柴胡湯臨床治療NTHi誘導(dǎo)的肺部炎癥提供了初步理論依據(jù)。