張月，金麗華

(東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖尿病是機體內(nèi)胰島素分泌或利用缺陷長期使葡萄糖積累在循環(huán)血液中，機體代謝平衡被破壞所引起的一種慢性疾病[1]，伴有多種并發(fā)癥如視網(wǎng)膜、腎臟、血管、神經(jīng)等功能性病變[2]。其中2型糖尿病最為常見，且發(fā)病率逐年上升[3-4],已經(jīng)嚴重影響人們的健康。目前的治療手段主要是通過藥物控制血糖的升高，比如注射胰島素或口服降糖的藥物等，用于防治相關的并發(fā)癥。然而此類藥物存在一定的副作用[5-6]。

中草藥毒副作用小、成本低廉、應用前景廣泛[7]。因此中醫(yī)藥對于糖尿病的治療越來越得到重視。野菊花為菊科多年生草本植物，以干燥頭狀花序入藥，是我國傳統(tǒng)藥用植物之一。主要化學成分包括萜類、黃酮類化合物、酚類等，具有抗炎、清熱解毒、降血壓等功效[8-9]。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)野菊花水提物可以緩解果蠅中由高糖飲食誘導的代謝紊亂及生長缺陷[10]，但野菊花在治療糖尿病方面的作用仍知之甚少。

果蠅調(diào)控葡萄糖穩(wěn)態(tài)的機制與人類非常相似，可作為研究2型糖尿病的重要模式生物，它的胰島素生理功能主要通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑發(fā)揮作用[11-12]。該途徑中的任何環(huán)節(jié)異常都可能導致胰島素抵抗，進而使機體糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡[13-14]。

研究發(fā)現(xiàn)果蠅chico及S6k的突變均導致個體體質量下降，并且影響細胞的代謝[15]。本實驗通過對chico和S6k突變體的蛹殼體積、成蟲體質量、脂肪體油滴大小、翅膀面積及單位面積內(nèi)翅膀細胞數(shù)方面的分析，研究喂食野菊花水提物對突變體果蠅生長發(fā)育及代謝功能的影響，為開發(fā)治療2型糖尿病的藥物提供理論基礎。

1 材料

1.1 藥材與試劑

野菊花(FlosChrysanthemiIndici, CI)頭狀花序，購買于黑龍江省哈爾濱市人民同泰大藥房，由東北林業(yè)大學生命科學學院馮富娟教授鑒定。氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)購自于Life Technologies公司。

1.2 實驗動物

野生型黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)w1118為本實驗室保存，突變體果蠅chico1/CyO及S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授提供。果蠅培養(yǎng)溫度(25±1)℃，相對濕度60%～70%。

1.3 儀器

ALC-210.4型電子分析天平，北京賽多利斯公司；Elix5型純化水系統(tǒng)，美國Millipore公司；SZ51型顯微鏡，日本Olympus公司；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡，德國Zeiss公司。

2 方法

2.1 野菊花水提液的制備

稱取20 g野菊花放入圓底燒瓶，加200 mL去離子水浸泡12 h，大火加熱煮沸后微火熬制3 h，紗布過濾收集濾液；濾渣再次加入200 mL去離子水同樣方法熬制3 h，收集兩次濾液濃縮至100 mL，得到質量濃度為0.2 g/mL(20%)的野菊花水提液，室溫冷卻后置-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 果蠅培養(yǎng)基的配制

對照組(正常培養(yǎng)基)：培養(yǎng)基配制方法參照文獻方法[16]。

實驗組(野菊花水提物培養(yǎng)基)：將對照組培養(yǎng)基中的去離子水替換成等體積的野菊花水提液，實驗組培養(yǎng)基中野菊花的質量分數(shù)為10%(0.1 g/mL)。

2.3 果蠅蛹殼體積及體質量的測定

正常培養(yǎng)基中孵化的野生型果蠅和突變體果蠅作為對照組，10%野菊花水提物培養(yǎng)基中孵化的突變體果蠅作為實驗組。將已經(jīng)孵化出成蟲果蠅的蛹殼放置于載玻片上，用毛刷蘸取甘油將其固定擺放整齊，每組分別收集30個蛹殼在顯微鏡下照相，利用ImageJ軟件測量蛹殼的長和寬后用公式計算體積并進行比較。公式：4/3π(L/2)(l/2)2(L，長度；l，寬度)[17]。隨機收集羽化24 h以內(nèi)的成蟲果蠅，雌雄分開，每組各30只，裝入已稱量好的EP管中在電子天平上稱量果蠅的體質量。每組重復5次計算平均體質量進行比較。

2.4 BODIPY和Phalloidin染色

室溫下每組果蠅隨機提取15～20只三齡幼蟲脂肪體于4%多聚甲醛中固定30 min，用PBST(PBS+0.1% Tween20)將組織清洗3次，每次5 min，然后在分別在Phalloidin和BODIPY中各染色30 min，DAPI染色10 min，每次染色后分別用PBST將組織清洗3次，每次5 min，最后slowfade封片在熒光顯微鏡下觀察拍照。利用ImageJ軟件測量脂肪體細胞大小和脂滴面積。

2.5 成蟲翅膀面積的測定

每組隨機收集20只雄果蠅翅膀，用石蠟油將其固定于載玻片上擺放整齊，顯微鏡下照相后利用Image J軟件測量分析。

2.6 統(tǒng)計學處理

采用Prism軟件進行統(tǒng)計學分析，組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析。

3 結果

3.1 對胰島素通路突變體果蠅個體大小的影響

為分析野菊花水提物對于突變體果蠅個體大小的影響，我們分別收集喂食不同培養(yǎng)基果蠅的蛹殼，顯微鏡下照相后計算其體積進行比較。結果表明，與野生型果蠅相比，chico1/CyO突變體蛹殼體積減少了27.7%，當突變體果蠅喂食10%野菊花后蛹殼體積顯著增加17%(圖1A-B)，說明喂食野菊花提取物可明顯緩解chico1/CyO突變體蛹殼體積減小的情況。

另外，胰島素信號傳導途徑中S6k是chico下游的基因，我們過去的研究發(fā)現(xiàn)野菊花水提物可以改善S6kl-1/TM6B突變體的生長缺陷[10]，這里我們對此進行了驗證。S6kl-1/TM6B突變體與野生型果蠅相比蛹殼體積減少了21.9%，當突變體喂食10%野菊花后蛹殼體積顯著增加23.6%(圖1C-D)，與過去的結論一致。說明野菊花水提物對chico1/CyO以及S6kl-1/TM6B突變體果蠅蛹殼體積減小情況均有明顯的緩解作用。

圖1 野菊花水提物對突變體果蠅蛹殼體積的影響(n=30)

3.2 對胰島素通路突變體果蠅體質量的影響

由于胰島素通路基因發(fā)生突變以后，個體顯著變小。因此，我們進一步分析了野菊花水提物對突變體果蠅成蟲體質量的影響。結果顯示，與野生型果蠅相比，chico1/CyO雌果蠅體質量降低11%，雄果蠅體質量降低26.9%。當突變體喂食10%野菊花后，雌果蠅體質量無明顯變化，但是，雄果蠅體質量顯著增加35.6%(圖2A-B)。

另外，我們也對之前研究發(fā)現(xiàn)的S6kl-1/TM6B突變體喂食10%野菊花后體質量進行了驗證，得到一致的結論。與野生型果蠅相比，S6kl-1/TM6B雌果蠅體質量降低了20.5%，雄果蠅體質量降低24.2%。當突變體果蠅喂食10%野菊花后，雌果蠅體質量變化不明顯，雄果蠅體質量顯著增加32%(圖2C-D)。結果表明野菊花水提物可以提高chico1/CyO和S6kl-1/TM6B突變體雄果蠅成蟲體質量。

圖2 野菊花水提物對突變體果蠅體質量的影響(n=150)

3.3 對S6kl-1/TM6B突變體果蠅翅膀大小的影響

個體變小主要是由于各個組織器官變小引起的，因此，我們進一步探究野菊花水提物對突變體果蠅翅膀大小的影響。我們對之前研究的S6kl-1/TM6B突變體喂食野菊花后翅膀面積進行了驗證，研究結論一致。與野生型果蠅相比，S6kl-1/TM6B突變體翅膀面積及單位面積內(nèi)翅膀細胞數(shù)分別減少了11.8%和14%。當突變體果蠅喂食10%野菊花后翅膀面積顯著增加11.5%，單位面積內(nèi)細胞數(shù)增加9.4%(圖3A-D)。說明野菊花水提物可以改善果蠅S6k突變后翅膀面積變小及單位面積內(nèi)翅膀細胞數(shù)量減少的情況。

圖3 野菊花提取物對S6kl-1/TM6B突變體 果蠅翅膀大小的影響(n=20)

3.4 對胰島素通路突變體果蠅脂肪代謝的影響

以上結果表明野菊花水提物可以緩解突變體果蠅的生長缺陷。為進一步探究野菊花水提物對突變體果蠅細胞大小以及脂肪代謝的影響，我們對果蠅的脂肪體細胞進行了分析。結果顯示，與野生型果蠅相比，chico1/CyO突變體脂滴面積、細胞核大小以及脂肪體細胞面積均顯著減小。當突變體喂食10%野菊花后，脂滴面積、細胞核以及脂肪體細胞面積分別顯著增加了30.4%、32%、28.6%(圖4A-D)。

另外我們之前的研究發(fā)現(xiàn)S6kl-1/TM6B雜合體喂食10%野菊花水提物后可以改善脂肪代謝，增加細胞大小。這里我們利用S6k純合突變體果蠅的脂肪體細胞進行了進一步分析。與野生型果蠅相比，S6kl-1/S6kl-1突變體果蠅脂滴面積、細胞核大小以及脂肪體細胞面積均顯著減小。當S6kl-1/S6kl-1喂食10%野菊花水提物后，其脂滴面積、細胞核以及脂肪體細胞面積分別顯著增加44%、33.7%、28.1%(圖4A-D)。說明野菊花水提物均能夠明顯改善突變體chico1/CyO及S6kl-1/S6kl-1的脂肪細胞大小減小及脂肪體代謝貯存情況。

圖4 野菊花水提物對突變體果蠅幼蟲 脂肪體細胞的影響(n=15～20)

4 討論

近年來，中醫(yī)對治療糖尿病的中藥進行了廣泛的研究，但每種中草藥的作用機理不同[18]。野菊花作為我國傳統(tǒng)藥用植物之一，具有抑菌、抗病毒、降血壓等功效被廣泛用于治療多種疾病[19]，且毒副作用小、安全、來源廣、成本低等優(yōu)點是西藥所不具備的。果蠅胰島素信號傳導途徑與哺乳動物具有高度的保守性[20]，所以利用果蠅模型快速篩選治療糖尿病的中藥。果蠅中控制能量代謝的相互拮抗兩條信號通路：胰島素信號通路(insulin pathway)和脂動激素(AKH)信號通路，負責管理能量的流動運輸和互換，即糖類和脂類物質[21]，果蠅中胰島素信號傳導與脂肪代謝緊密相關[22]。

本實驗通過對胰島素通路突變體果蠅喂食野菊花水提物后生長狀態(tài)以及脂肪貯存等方面進行分析，表明突變體喂食野菊花水提物后蛹殼體積、體質量、脂肪代謝情況及翅膀面積均得到了明顯的改善。說明野菊花水提物對于胰島素通路突變體果蠅的生長缺陷有一定的緩解作用，但具體影響果蠅發(fā)育代謝的機制以及野菊花水提物針對抗糖尿病方面的具體藥理藥性仍然需要進一步的實驗研究。我們的結果為野菊花在治療糖尿病方面的開發(fā)和利用提供新的思路。