谷悅

摘要 [目的]研究去甲基川陳皮素（5-demethylnobiletin，5DN）對(duì)前列腺癌細(xì)胞活性的影響。[方法]通過MTT法檢測(cè)5DN對(duì)PC3和DU145細(xì)胞的毒性。運(yùn)用DAPI細(xì)胞核染色、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)探究5DN對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡、遷移的影響。[結(jié)果]5DN對(duì)PC3和DU145細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，IC50分別為49.33、54.14 μmol/L。5DN處理后在2個(gè)細(xì)胞系中抑制細(xì)胞凋亡基因（Bcl-2、AKT1、AKT2）的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，促進(jìn)凋亡基因（caspase-3、Bax）的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。DU145中促進(jìn)凋亡基因PTEN的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，促凋亡蛋白caspase 9的表達(dá)量顯著升高。同時(shí)，5DN能有效抑制PC3細(xì)胞的遷移。[結(jié)論] 5DN能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡并抑制它的增殖和遷移。

關(guān)鍵詞 去甲基川陳皮素;前列腺癌細(xì)胞;抗癌活性

中圖分類號(hào) R285文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0166-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.051

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Anticancer Activity of 5demethylnobiletin against Prostate Cancer Cells PC3 and DU145

Abstract [Objective] The aim was to study the effect of 5demethylnobiletin （5DN） on the activity of prostate cancer cells. [Method] The toxicity of 5DN to PC3 and DU145 cells was detected by MTT assay.DAPI nucleic acid staining， RTqPCR， Western blotting， Wound healing assay were used to investigate the effects of 5DN on apoptosis， proliferation and migration of prostate cancer cells. [Result] 5DN significantly inhibited the proliferation of PC3 and DU145 cells with IC50 of 49.33 and 54.14 μmol/L， respectively. After 5DN treatment， the transcriptional levels of genes that inhibit apoptosis， such as Bcl2， AKT1， and AKT2， were significantly decreased， and the transcriptional levels of apoptosispromoting genes such as caspase3 and Bax were significantly increased in two cell lines. In DU145， the transcription level of PTEN mRNA was significantly increased， and the expression level of caspase 9 protein was significantly increased. At the same time， 5DN could effectively inhibit the migration of PC3 cells. [Conclusion] 5DN can induce the apoptosis of prostate cancer cells and inhibit its proliferation and migration.

Key words 5demethylnobiletin;Prostate cancer;Anticancer activity

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31772260）。

作者簡(jiǎn)介 谷悅（1993—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：果品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全。

收稿日期 2019-02-22

前列腺癌是中老年男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1]，發(fā)病率在全球呈逐年升高的趨勢(shì)[2]。雖然我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率低于西方國(guó)家，但前列腺癌發(fā)展速度迅猛、致死率高，隨著我國(guó)人口的老齡化前列腺癌患病的人數(shù)將不斷增多[3]。目前，前列腺癌的治療方法主要有手術(shù)治療、放療、化療、內(nèi)分泌治療等[4]。但傳統(tǒng)的治療方法效果不理想，復(fù)發(fā)率高，還會(huì)產(chǎn)生腫瘤耐藥性，影響化療效果[5]。因此，尋找副作用小、藥效好的抗腫瘤化合物顯得更加必要。

多甲氧基黃酮（polymethoxylated flavones，PMFs）是柑橘屬植物特有的，一類高度甲氧基化的黃酮類化合物（flavanoids）[6]。研究表明，PMFs具有一系列生物活性，包括預(yù)防糖尿病[7]、心腦血管疾病[8]，抗氧化[9]、抗炎和抗癌作用[10]。在已經(jīng)鑒定的70多種PMFs中[11]，去甲基多甲氧基黃酮作為PMFs的一個(gè)獨(dú)特的亞類，具有很強(qiáng)的抗癌活性，包括肺癌[12]、結(jié)腸癌[13]和乳腺癌[14]。去甲基川陳皮素（5-demethylnobiletin，5DN）是柑橘類水果中含量最豐富的去甲基多甲氧基黃酮。研究表明，5DN能促進(jìn)肺癌細(xì)胞中聚合微管蛋白的形成，通過JNK活化導(dǎo)致肺癌細(xì)胞G2/M期阻滯，從而有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖[15]。膳食5DN能抑制香煙致癌物NNK誘導(dǎo)的小鼠肺腫瘤發(fā)生[16]。但是，5DN對(duì)人前列腺癌細(xì)胞的活性影響還鮮見報(bào)道。

該研究以人源前列腺癌細(xì)胞系PC3和DU145為細(xì)胞模型，研究5DN對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移的影響，尋找一種天然化合物為前列腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。去甲基川陳皮素（5DN）（純度≥98%）來自Li等[17]對(duì)柑橘大紅袍的PMFs分離純化研究。

1.1.2 試驗(yàn)細(xì)胞系。人源前列腺癌細(xì)胞PC3和DU145系來自重慶文理學(xué)院創(chuàng)新靶向藥物國(guó)際研究院。

1.1.3 試劑。胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司;青霉素-鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;DMEM和F-12K培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）溶液、DMSO（二甲基亞砜）溶液、DAPI（40，60-二脒基-2-苯基吲哚）細(xì)胞核染色液、結(jié)晶紫染色液，均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;合成引物購(gòu)于中國(guó)華大基因公司;caspase 9和β-actin 蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;BCA試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天公司;PVDF膜購(gòu)于美國(guó)Merck Millipore公司;試驗(yàn)使用的所有其他化學(xué)品均來自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.1.4 儀器。雙色紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey CLx），美國(guó)LI-COR公司;酶標(biāo)儀（Cytation 5），美國(guó)Bio TeK公司;小型垂直電泳槽（Mini-PROTEAN Tetra），美國(guó)Bio-Rad公司;倒置熒光顯微鏡（ix73），日本Olympus公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱（BB15），美國(guó)Thermo Electron公司;PCR儀（S1000），美國(guó)Bio-Rad公司;超純水系統(tǒng)（Milli-Q Advantage A10），美國(guó)Millipore公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler96），瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。PC3和DU145人前列腺癌細(xì)胞系細(xì)胞分別培養(yǎng)在含10%（V/V）、胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（V/V）、DMEM和F-12K培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)（MTT）。采用MTT法檢測(cè)5DN對(duì)人源性前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞的體外抗增殖活性。將PC3和DU145細(xì)胞以4×103個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔微量培養(yǎng)板中孵育24 h，當(dāng)孔中細(xì)胞貼壁密度在70%～80%時(shí)，加入不同濃度（0～150 μmol/L）的5DN處理細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照，平行設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，向每個(gè)孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL）溶液，在37 ℃、5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液，每個(gè)孔中加入150 μL DMSO溶液，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶體完全溶解。最后通過酶標(biāo)儀在 λ562nm處讀數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率，并采用Logit法計(jì)算細(xì)胞50%抑制濃度（IC50）。細(xì)胞存活率表示為：細(xì)胞存活率= OD檢測(cè)/OD對(duì)照×100%。

1.2.3 DAPI細(xì)胞核染色。PC3和DU145細(xì)胞（1×104個(gè)/孔）分別接種于24孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，加入不同濃度的5DN（0、50、75 μmol/L）處理細(xì)胞，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。然后棄去上清液，用PBS洗滌2次，并用4%多聚甲醛固定15 min。用PBS洗滌固定的細(xì)胞，并用DAPI（100 ng/mL）染色15 min。最后，除去DAPI溶液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。 通過熒光顯微鏡觀察拍照，最大吸收波長(zhǎng)為364 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為454 nm。

1.2.4 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)。 PC3細(xì)胞（5×104個(gè)/孔）接種于6孔板中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)貼壁細(xì)胞密度達(dá)到90%，第2天換低濃度血清培養(yǎng)基，使用1 mL槍頭垂直對(duì)準(zhǔn)6孔板的下端中央部位，向上輕推形成劃痕，劃十字。用PBS清洗掉懸浮的細(xì)胞后加入5DN（75 μmol/L）處理細(xì)胞，設(shè)置空白對(duì)照組，平行設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。倒置熒光顯微鏡，0 h拍照，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h后再拍照。用軟件ImageJ 計(jì)算分析遷移面積。遷移面積=72 h的細(xì)胞面積-0 h的細(xì)胞面積。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。 PC3和DU145細(xì)胞經(jīng)不同濃度5DN處理后，收獲細(xì)胞，采用試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，檢測(cè)RNA的濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將制備好的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)引物序列（表1），反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，45 個(gè)循環(huán); 60 ℃ 60 s。β-actin基因作為內(nèi)參。完成后采用PCR儀自帶軟件qbase plus 進(jìn)行分析。

1.2.6 蛋白免疫印跡法。 PC3和DU145細(xì)胞經(jīng)不同濃度5DN處理后，收獲細(xì)胞，使用BCA試劑盒測(cè)定濃度。制備SDS-PAGE分離膠，將配好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，通過SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白樣品（120 V、90 min）。電泳后在4 ℃下100 V轉(zhuǎn)120 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。室溫下，將膜在含5%脫脂奶粉PBS溶液中封閉1 h，并在4 ℃下孵育一抗（caspase 9 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）過夜。在室溫下孵育二抗1 h。各抗體均用TBST溶液洗滌3次，6 min/次。然后將膜置于雙色紅外激光成像系統(tǒng)中檢測(cè)。使用ImageJ讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05），采用GraphPad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5DN對(duì)PC3和DU145 的細(xì)胞毒性

采用MTT法檢測(cè)5DN對(duì)人源性前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞的體外抗增殖活性。用一定濃度范圍的5DN（0～150 μmol/L）處理PC3和DU145細(xì)胞48 h后，PC3和DU145細(xì)胞的IC50分別為4933、54.14 μmol/L（圖1），PC3細(xì)胞對(duì)5DN可能更敏感。結(jié)果顯示，5DN對(duì)PC3和DU145細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。PC3和DU145細(xì)胞在一定的濃度范圍內(nèi)都存在計(jì)量依賴性（圖1），PC3細(xì)胞的計(jì)量依賴性較明顯。

2.2 5DN誘導(dǎo)PC3和DU145 產(chǎn)生凋亡小體

為了研究5DN對(duì)癌細(xì)胞的抑制增殖活性是否與細(xì)胞的凋亡有關(guān)，采用DAPI細(xì)胞核酸染色液對(duì)經(jīng)過不同濃度5DN（0、50、75 μmol/L）處理48 h的PC3和DU145細(xì)胞進(jìn)行染色。結(jié)果如圖2所示，DU145細(xì)胞在75 μmol/L 5DN 后出現(xiàn)了核收縮，染色質(zhì)濃縮并形成凋亡小體（紅色箭頭）;PC3細(xì)胞在50和75 μmol/L都出現(xiàn)了凋亡小體，75 μmol/L處理組凋亡小體明顯增多。說明5DN對(duì)PC3和DU145的細(xì)胞毒性可能與凋亡相關(guān)。

2.3 5DN誘導(dǎo)PC3和DU145細(xì)胞的凋亡

為了研究5DN引起PC3和DU145細(xì)胞凋亡的機(jī)制，對(duì)與凋亡相關(guān)的一些重要基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量進(jìn)行了研究。PC3和DU145細(xì)胞經(jīng)5DN處理后，75 μmol/L 5DN處理組的caspase-3的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，Bax 的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著5DN的濃度增加顯著升高，75 μmol/L處理組的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照的2倍（圖3）。由于PC3細(xì)胞PTEN基因缺失，檢測(cè)不到PTEN基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。但是在DU145細(xì)胞中PTEN基因的轉(zhuǎn)錄水平隨著5DN的濃度增加顯著升高（圖3）。在2個(gè)細(xì)胞系中抑制細(xì)胞凋亡的基因如Bcl-2、AKT1、AKT2 的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著5DN的濃度增加都顯著降低（圖3）。DU145經(jīng)5DN處理后caspase 9蛋白的表達(dá)量隨著5DN的濃度增加顯著升高（圖4）。結(jié)果表明5DN可能通過線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。

2.4 5DN抑制PC3細(xì)胞的遷移

通過細(xì)胞劃痕試驗(yàn)研究5DN對(duì)PC3細(xì)胞遷移的影響。 72 h后75 μmol/L 5DN處理組的遷移率為7.82%，對(duì)照組細(xì)胞遷移率為52.58%。 5DN處理組與對(duì)照組細(xì)胞相比，遷移率減少44.76%。同時(shí)對(duì)促進(jìn)細(xì)胞遷移基因c-Myc的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，隨著5DN濃度的增加，c-Myc的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。進(jìn)一步說明，5DN能夠抑制PC3細(xì)胞的遷移（圖5～6）。

3 結(jié)論與討論

由于PMFs獨(dú)特的多甲氧基結(jié)構(gòu)，很多PMFs類物質(zhì)對(duì)前列腺癌細(xì)胞都存在一定的抗癌活性[18]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，橘皮素通過靶向PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)PC3細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的重編程，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[19-20]。川陳皮素通過AKT通路抑制前列腺癌PC-3和DU-145細(xì)胞的活性[21]。

該研究通過細(xì)胞毒性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)5DN對(duì)人源前列腺癌PC3和DU145細(xì)胞的活性具有顯著的抑制作用，這種抑制作用可能與細(xì)胞的凋亡相關(guān)。細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，許多抗腫瘤藥物都通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制來殺死腫瘤細(xì)胞[22]。其中線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡極為重要。線粒體介導(dǎo)的凋亡中包括很多與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因如caspase家族基因和Bcl-2家族基因[23]。該研究顯示5DN能抑制抗凋亡基因Bcl-2、AKT1、AKT2 的mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)凋亡基因caspase-3、PTEN和Bax的轉(zhuǎn)錄。caspase-9作為一種促凋亡因子，是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，也是caspase家族中引起細(xì)胞凋亡的最關(guān)鍵成分之一[24]。DU145細(xì)胞經(jīng)5DN處理后能上調(diào)caspase 9蛋白的表達(dá)。綜上所述，表明5DN可能通過線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通常是由于癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移能力。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5DN能有效抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移。該研究雖然發(fā)現(xiàn)5DN能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，但是其具體的作用信號(hào)通路尚不明確，還有待進(jìn)一步研究。

該研究首次研究了5DN對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)5DN通過促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡和抑制它的增殖和遷移，抑制PC3和DU145細(xì)胞的活性。上述體外試驗(yàn)結(jié)果為5DN的體內(nèi)抗腫瘤活性研究以及進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為尋找有效治療前列腺癌的藥物提供了新思路。

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