張謙 孫宗昭 王學(xué)術(shù) 魯玉成 肖利元 王軍

摘要 對(duì)金銀花根腐病發(fā)生規(guī)律進(jìn)行觀察，并對(duì)金銀花根部微生物進(jìn)行分離，確定了金銀花根腐病的發(fā)生規(guī)律及病原菌，通過傷口侵染造成金銀花整株發(fā)病。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土壤環(huán)境、根系損傷程度與根腐病發(fā)病程度相關(guān)密切。

關(guān)鍵詞 金銀花;根腐病;病原;微生物

中圖分類號(hào) S436.8+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）13-0129-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.040

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Occurrence Regularity and Pathogen Identification of Honeysuckle Root Rot

Abstract The occurrence regularity of honeysuckle root rot was observed， the microorganism in the root of honeysuckle was separated continuously， the occurrence rule and pathogenic bacteria of honeysuckle root rot were determined， and the whole honeysuckle disease was caused by wound infection. Field investigation showed that soil environment and root system damage were closely related to the incidence of root rot.

Key words Honeysuckle;Root rot;Pathogen;Microorganism

基金項(xiàng)目 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中草藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介 張謙（1967—），男，山東臨沂人，高級(jí)農(nóng)藝師，從事中草藥規(guī)范化栽培技術(shù)研究與應(yīng)用。

收稿日期 2019-01-16

金銀花（Lonicera japonica Thunb.），又名忍冬?！敖疸y花”一名出自《本草綱目》，由于忍冬花初開為白色，后轉(zhuǎn)為黃色，因此得名金銀花。其功效主要是清熱解毒，主治溫病發(fā)熱、熱毒血痢、癰疽疔毒等。平邑為金銀花道地產(chǎn)區(qū)，多年保持金銀花種植面積4.33萬hm2，年產(chǎn)干花1.8萬t。近幾年金銀花老園區(qū)占比逐年增加，疏于管理，土地板結(jié)，根腐病逐年加重。根據(jù)田間調(diào)查，2018年平邑縣金銀花根腐病發(fā)病率達(dá)20%～30%，減產(chǎn)30%以上，嚴(yán)重制約了金銀花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。筆者對(duì)金銀花根腐病的發(fā)生規(guī)律與病原鑒定進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

平邑主栽品種為中花一號(hào)。

1.2 試驗(yàn)地及生態(tài)特征

平邑縣鄭城鎮(zhèn)武城村，株齡為4年，栽植密度為1.0 m×1.0 m，通風(fēng)透光不良，植株長(zhǎng)勢(shì)中等，枝葉茂密;平邑縣鄭城鎮(zhèn)鞏家山村，株齡4年，栽植密度1.0 m×1.5 m，通風(fēng)透光良好，植株長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)。

1.3 病害調(diào)查

對(duì)2處具有代表性的金銀花種植園采用五大點(diǎn)取樣法，每次取樣5株，重復(fù)4次，調(diào)查確定2處金銀花種植區(qū)根腐病發(fā)生情況;并按常規(guī)方法進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，使用PDA培養(yǎng)基，在28～32 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～7 d后，檢查記錄菌落形態(tài)等，繼而利用菌懸液接種金銀花根部，確定病原菌[1]。

1.3.1 病原菌的分離純化。

每試驗(yàn)園確定10株不同感病程度的金銀花根腐病植株，進(jìn)行連續(xù)觀察，按常規(guī)方法進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)[2]（即使用PDA培養(yǎng)基，在28～32 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3～7 d后，檢查記錄菌落形態(tài)）。同時(shí)，對(duì)分離出的菌株進(jìn)行純化保存。

1.3.2 病原菌株類型的確定。

對(duì)培養(yǎng)后的真菌病原菌株，進(jìn)行菌體及孢子形態(tài)的觀察，確定其病原類型[3];對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行菌落形態(tài)和顏色、革蘭氏染色和鞭毛染色觀察，確定其基本性狀和特征，確定其病原類型。

1.3.3 病原菌株的致病性測(cè)定。

1.3.3.1 接種用菌株的制備。

對(duì)分離純化的Alternatia sp、Trichothecim sp和 Fusarium sp菌株，分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～7 d，使其形成足量的分生孢子[4];細(xì)菌BA1、BA2，培養(yǎng)2 d;分別制備1×106 CFU/mL的孢子懸浮液待用。

1.3.3.2 接種方法。

將健康金銀花幼株分為2組，一組采取損傷根部用孢子懸浮液進(jìn)行接種，一組直接用孢子懸浮液進(jìn)行接種[5]，分刺傷和無傷2種接種處理方法，每處理10株，重復(fù)3次，以無菌水作為空白對(duì)照。接種后室溫放置，連續(xù)觀察發(fā)病情況。

1.4 病原菌鑒定

對(duì)分離純化的Fusarium sp.菌株，分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～7 d，使其形成足量的分生孢子。

1.4.1 DNA模板的制備。

將尖鐮孢菌（Fusarium sp）的菌液分別提取全基因組DNA。具體操作：室溫1 500 r/min離心5 min，去除上清。菌體重懸于3 mL ddH2O，振蕩混勻;加入500 μL lysis Buffer重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中;加入0.3 g小珠子與25 μL 5 mol/L NaCl;最大振速振蕩2 min;室溫2 000 r/min離心2 min，去除上清;加入550 μL酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），顛倒混勻;室溫10 000 r/min 離心2 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管;加入550 μL氯仿∶異戊醇（24∶1），顛倒混勻;室溫10 000 r/min離心2 min，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中;加入1.1 mL預(yù)冷的95%乙醇，-20 ℃靜置1 h;室溫13 200 r/min離心5 min，去除上清;加入 1 mL 70%乙醇，室溫吹干;加入10 μL TE 溶解基因組DNA。將達(dá)到試驗(yàn)要求的總DNA進(jìn)行分裝，分別置于4 ℃和-20 ℃保存?zhèn)溆肹6]。

1.4.2 單一PCR擴(kuò)增與檢測(cè)。

病原菌尖鐮孢菌目的基因CAM的PCR引物序列見表1。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。試驗(yàn)體系：10×PCR 緩沖液3 μL，Mg2+（25 mmol/L）15 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶2.5 U，加超純水至30 μL。單一PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃，5 min;（95℃，1 min;61.0 ℃/62.3 ℃/63.6 ℃/64.2 ℃/65 ℃，1 min;72 ℃，1 min）30個(gè)循環(huán);72 ℃，10 min;10 ℃保存。PCR完成后電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，然后用GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（上海捷瑞）純化產(chǎn)物。將回收的DNA與pMD19-T載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化（感受態(tài)細(xì)胞使用DH5α），單克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌株特征

從表2可以看出，從不同病根類型中分離純化出的主要病原可確定為BA1、BA2、Alternatia sp.、Trichothecim sp.和Fusarium sp.。其菌落形態(tài)見圖1。

2.2 病原菌致病性

由表3可知，F(xiàn)usarium sp.通過傷口侵染，單獨(dú)和復(fù)合侵染均引起發(fā)病;而Trichothecim sp.和Alternatia sp.單獨(dú)接種不引起發(fā)病，與其他病原復(fù)合接種引起發(fā)病，因此認(rèn)為其為次要病原菌或非病原菌[8];BA1和 BA2在一定程度上降低了發(fā)病率，有可能是病原菌的拮抗菌。

2.3 病原菌特異性基因的擴(kuò)增

用特異引物對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)PCR反應(yīng)的特異性。擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，病原菌特異性基因的引物均擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物CAM、16S rDNA、fliC。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，確認(rèn)為各病原菌特異性產(chǎn)物。結(jié)果顯示，病原菌的特異性引物均具有良好表現(xiàn)，符合鐮刀病原菌的分子鑒定。

3 結(jié)論與討論

金銀花根腐病是制約金銀花生產(chǎn)的主要因素，該研究結(jié)

果表明，金銀花根腐病主要是由真菌病原F.oxysporum通過傷口侵染引起的病害。另外從田間病害的發(fā)生情況發(fā)現(xiàn)，不同土壤環(huán)境下金銀花根腐病發(fā)生程度有差異[9]，即在土壤酸化、鹽漬化的金銀花種植園中，根腐病發(fā)生較重，且病根中分離獲得的病原菌較多;而偏中堿性的砂質(zhì)壤土的種植園[10]，病害發(fā)生較輕，且以根部有蟲傷危害的植株為主[10]，F(xiàn).oxysporum從病株中分離獲得的概率最高;而詳細(xì)情況需要進(jìn)一步研究確定。

參考文獻(xiàn)

[1] WANG J，XU T T，YIN L C，et al.Nitrate addition inhibited methanogenesis in paddy soils under longterm managements[J].Plant Soil Environ，2018，64（8）：393-399.

[2] JETTEN M S M，VAN? NIFTRIK L，STROUS M，et al.Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria[J].Critical reviews in biochemistry and molecularbiology，2009，44（2/3）：65-84.

[3] JIA Z J，CONRAD R.Bacteria rather than Archaea dominate microbial ammonia oxidation in an agricultural soil[J].Environmental microbiology，2009，11（7）：1658-1671.

[4] JIN R C，YANG G F，YU J J，et al.The inhibition of the Anammox process：A review[J].Chemical engineering journal，2012，197：67-79.

[5] WANG J，DENG H，WU S S，et al.Assessment of abundance and diversity of exoelectrogenic bacteria in soil under different land use types[J].Catena，2019，172：572-580.

[6] GALLOWAY J N，DENTENER F J，CAPONE D G，et al.Nitrogen cycles：Past，present，and future[J].Biogeochemistry，2004，70（2）：153-226.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：221.

[8] 彭素琴，謝雙喜.金銀花的生物學(xué)特性及栽培技術(shù)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31（5）：27-29.

[9] 王天志，李永梅.金銀花的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志，2000，15（4）：292-294，298.

[10] 王軍，施雨，李子媛，等.生物炭對(duì)退化蔬菜地土壤及其修復(fù)過程中N2O產(chǎn)排的影響[J].土壤學(xué)報(bào)，2016，53（3）：713-723.