宋一嵐 張英杰 孫紀霞 張京偉 郭文姣 劉述河 丁朋松 王鐳 房義福 劉學慶

摘要 以紅魔帝兜蘭為試驗材料，利用掃描電子顯微鏡對紅魔帝花粉的超微結構進行觀察，通過TTC（氯化三苯基四氮唑）染色對紅魔帝兜蘭的花粉活力進行研究，并用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定其柱頭可授性。結果表明，兜蘭隨著開放時間的延長花粉變硬，體積變小，花粉塊黏性減弱;TTC染色法檢測結果表明，花粉活力表現(xiàn)為開花10～30 d>開花10 d>花蕾期;柱頭可授性測定結果表明，兜蘭開花10～30 d人工雜交成功率較高，其中10～15 d授粉率最高。

關鍵詞 兜蘭;花粉形態(tài);花粉活力;柱頭可授性

中圖分類號 S682.31文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0053-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.017

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Pollen Viability and Stigma Receptivity of Paphiopedilum

Abstract Paphiopedilum maudiaewas used as the research material to observe the ultrastructure of P.maudiae type pollen by scanning electron microscope. The pollen viability of Paphiopedilum maudiae was studied by TTC（2，3，5triphenyltetrazolium chloride） staining. The results showed that with the prolongation of the opening time， the pollen of a paphiopedilum became hard， the volume became smaller and the stickiness of the pollen mass decreased. TTC staining showed that pollen viability was > at 10-30 days after flowering and > 10 days after flowering. Stigma grafting assay showed that the success rate of artificial hybridization was a little higher within 10-30 days after flowering， and the pollination rate was the highest within 10-15 days after flowering.

Key words Paphiopedilum;Pollen morphology;Pollen viability;Stigma receptivity

兜蘭（Cypripedium corrugatum Franch.），又稱拖鞋蘭，為蘭科多年生草本。其喜溫暖半陰環(huán)境，花型奇特;魔帝類兜蘭（P.maudiae）為雜交種，栽培管理容易操作，市場價值較高，目前以無菌播種為主要繁殖方式[1]。兜蘭屬雜交育種有100年歷史，目前已有20 262個雜交種在英國皇家園藝協(xié)會（RHS）登錄[2]。兜蘭雜交育種的成功主要依賴花粉和柱頭的高活性，國內外對于花粉活力的測定主要依靠花粉活性染色的方法，染色法多為TTC法[3]。同時，柱頭可授性檢測方法多為聯(lián)苯胺-過氧化氫法。目前對蘭科花粉形態(tài)、活性和柱頭可授性的研究很少，國外研究集中在蘭科花粉形態(tài)學，孫崇波等[3]對蘭科5屬10種21個品種（系）的花粉塊形態(tài)學進行研究，喻蘭等[11]對“天香公主”蝴蝶蘭的花粉活力及柱頭可授性進行了研究。筆者通過對紅魔帝的花粉形態(tài)學、花粉活力及柱頭可授性研究，旨在為兜蘭紅魔帝人工授粉提供技術指導，同時彌補國內對蘭科植物花粉形態(tài)、活力及柱頭可授性研究的不足。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在山東省煙臺市農(nóng)業(yè)科學研究院的連棟溫室（121°16′26″E、37°29′2″N，海拔6 m）進行，供試材料為紅魔帝兜蘭。

1.2 兜蘭花粉電鏡掃描

采取不同花期的紅魔帝花粉均勻涂抹在樣品托的雙面膠帶上，經(jīng)EM ACE200型離子濺射儀噴金后，置于SU8010掃描電子顯微鏡下觀察。選取不同倍數(shù)的視野對花粉進行拍照記錄。

1.3 氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

參照喻蘭等[11]的方法，配制新鮮的1.5%TTC染色液，取少量不同花期的紅魔帝花粉，將新鮮花粉搗碎置于1.5 mL離心管中，加入1.5%TTC染色液染色。花蕾期花粉常溫、黑暗處理12 h后用移液槍取少量花粉混合液于載玻片上，蓋上蓋玻片在光學顯微鏡下觀察統(tǒng)計花粉活力，開花10～15 d的花粉和盛花期的花粉染色處理24 h后觀察，每個開花時期均制片3張，每張片子隨機選取5個視野的染色率進行統(tǒng)計分析，有活力的花粉被染色為紅色，無活力的未被染色，試驗重復3次，拍照記錄，計算花粉活力?；ǚ刍盍?有活力的花粉/觀察花粉總數(shù)×100%。

1.4 柱頭可授性檢測

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定紅魔帝柱頭可授性。配制新鮮的聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22）[11]，于10：00采集不同開花時期的新鮮雌蕊柱頭置于培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿中加入適量聯(lián)苯胺-過氧化氫反應液，10 min后觀察柱頭顏色和氣泡變化。無氣泡和顏色變化的柱頭視為無可授性，有少量氣泡和少許顏色變藍的柱頭具有可授性，柱頭有超過2/3顏色變藍及大量氣泡產(chǎn)生的為具有可授性且可授性強。