陳智慧　譚麗珊　郭慧　馬美春

【摘要】 目的：探討乳腺癌組織冰凍與否對其常用免疫組織化學結果的影響。方法：收集近年來60例乳腺浸潤性導管癌根治手術的病理組織蠟塊（必須有術中冰凍病理檢查），時間為2016年1月-2017年12月，將標本分別對應分類為冰凍組織與冰剩組織，分別制作成冰凍芯片與冰剩芯片，采用免疫組織化學S-P法檢測ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53陽性表達情況，并對比術中冰凍病理結果與術后石蠟病理的符合率。結果：冰凍芯片與冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結果比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。冰剩組織與術后石蠟病理對比，組織學大小≤3 cm符合率93.75%，組織學大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學級別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論：乳腺癌組織冰凍會影響乳腺癌標記物的陽性表達，建議病理醫(yī)師選擇冰剩組織進行免疫組織化學染色，從而為患者提供更精準的結果。

【關鍵詞】 免疫組織化學; 冰凍芯片; 乳腺癌組織; 冰剩芯片

【Abstract】 Objective：To discuss the impact of frozen breast cancer tissues on the immunohistochemical analysis results.Method：The pathological tissue paraffin blocks about 60 invasive ductal carcinoma patients underwent the radical operation（the frozen pathological examination was required during surgery）from January 2016 to December 2017 were collected.The specimens of the frozen tissues and remaining frozen tissues were made as the frozen paraffin block and remaining frozen paraffin block.The immunohistochemistry（S-P）method was used to detect the positive rate of estrogen receptor（ER），progesterone receptor（PR），cerbB-2 protein，Ki-67 and P53，the pathological coincidence rate of frozen paraffin block during surgery and postoperative paraffin block after surgery was compared.Result：The positive results of cerbB-2 protein，Ki-67，P53，ER and PR in frozen chips were significantly different from those in frozen chips（P<0.05）.Compared with paraffin pathology after operation，the coincidence rate of histological size ≤3 cm was 93.75%，and that of histological size >3 cm was 100%，there was significant difference between two groups（字2=6.398，P=0.011<0.05），and the overall coincidence rate was 95.00%（57/60）.At histological level，the overall coincidence rate was 91.67%（55/60），which was significantly different from that of frozen section（P<0.05）.Conclusion：The positive expressions of breast cancer markers are affected by the frozen breast cancer tissues.In order to improve the diagnosis accuracy，the pathologist shall take the remaining tissues to do the immunohistochemical staining.

【Key words】 Immunohistochemistry; Frozen paraffin block; Breast cancer tissues; Reaming frozen paraffin block

First-authors address：Shaoguan First Peoples Hospital，Shaoguan 512000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.14.031

乳腺癌在我國婦女中較為高發(fā)，發(fā)病率占婦女腫瘤的31%。早在20世紀50年代有學者就提出，對于乳腺癌，僅進行手術治療是不夠的，需要進行系統(tǒng)性的輔助治療[1]。近年來針對cerbB-2等標記物表達的靶向治療方案在乳腺癌輔助治療中成為研究熱點。當前乳腺癌常用的標記物有雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、細胞增殖抗原標記物（Ki-67）、cerbB-2及P53等，而各種標記物的陽性百分率將直接影響患者的選擇用藥及預后判斷。通常乳腺癌手術會行術中冰凍切片，在送檢組織中將選取部分腫物制作冰凍切片（冰凍組織），剩余腫物（冰剩組織）將待冰凍切片完成后一同固定制作組織蠟塊用于常規(guī)病理診斷。而后，病理科將面臨如何選擇組織蠟塊行免疫組化，冰凍組織還是冰剩組織，以便為患者提供更精準的結果目前鮮有報道。本研究中將采用回顧性研究，采用成熟的組織芯片技術，在同等條件下，對比近年來本科室乳腺癌冰凍組織與冰剩組織對應的常用免疫組化結果。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取60例乳腺浸潤性導管癌患者，時間為2016年1月-2017年12月，患者均行乳腺浸潤性導管癌根治手術?；颊呔鶠榕?，年齡35～66歲，平均（56.8±3.3）歲。納入標準：未發(fā)生遠處轉移;術前未進行過放化療。排除標準：合并其他腫瘤;有精神病史。該研究已經倫理學委員會批準。

1.2 方法 由副主任醫(yī)師及以上職稱人員進行取材或指導取材，選取可疑病變處進行取材，所有標本均為術中送檢的未固定新鮮組織。在送檢組織中將選取部分腫物制作冰凍切片（冰凍組織），剩余腫物（冰剩組織）將待冰凍切片完成后一同固定制作組織蠟塊，分別制作成冰凍芯片與冰剩芯片。

1.2.1 冰凍切片制作 取新鮮組織平放于冷凍頭上，放入OCT包埋劑適量，進行冷凍操作，速凍后切成厚4～5 μm的切片，將其貼在防脫載玻片上。70 ℃預熱丙酮固定液，切片置于其內固定2 min后，進行HE染色，由病理科醫(yī)師對切片進行病理診斷，30 min內發(fā)出冰凍報道后，將冰剩組織做成常規(guī)石蠟切片，并與冰凍切片結果比較。

1.2.2 組織芯片制作 （1）HE切片于顯微鏡下明確并標記癌巢;（2）借助HE切片于供體蠟塊的相應部位標記為取材部位;（3）將普通病理石蠟融化，進行3次的反復沉淀，加入3%精制蜂蠟，制作成空白蠟塊，大小4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，室溫冷卻;（4）設計10×8點組織列陣，制成模塊，從供體蠟塊的選定部位用直徑0.6 mm的打孔針將組織芯逐個取出，放入預先設計的陣列模塊中，于60 ℃保溫箱中放置制成的組織芯片模塊，輕壓模塊使其排平。將模塊切成薄片，厚3 ?m裱于防脫玻片上，60～70 ℃ 1 h。

1.2.3 檢測方法 采用免疫組織化學S-P法檢測，標準化試驗條件：用全自動免疫組化機器對各芯片進行染色，每次完成一個抗體標記物，即保證標記每一抗體的所有芯片一次性完成試驗，所有步驟均由機器自動化完成。所需設備：全自動免疫組化機器（生產廠家：瑞士羅氏公司，型號：Benchmark XT）;試劑：全套羅氏二抗檢測試劑ultraView Universal DAB;各種一抗標記物（北京中杉公司）：ER、PR、cerbB-2、Ki-67、P53等;羅氏免疫機所需各種反應試劑：EZprep、LCS、SSC、Reaction Buffer、CC1。

1.3 陽性結果判斷標準 Ki-67、P53陽性部位為細胞核，棕黃色，陽性細胞數(shù)<10%為陰性（-），陽性細胞數(shù)10%～25%為弱陽性（+），陽性細胞數(shù)26%～50%為陽性（++），陽性細胞數(shù)>50%為強陽性（+++）[2]。cerbB-2陽性細胞為膜著色;細胞數(shù)>10%為陽性，著色中等部分不連續(xù)為陽性（++），著色弱且不連續(xù)為弱陽性（+），著色強且連續(xù)為強陽性（+++）[3-4]。ER和PR以核出現(xiàn)棕黃色為陽性，著色細胞數(shù)<10%為陽性（+），10%～50%為弱陽性（++），著色細胞數(shù)>50%為強陽性（+++）[5]。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各種標記物的陽性結果 病例間各標記物陽性表達存在重疊現(xiàn)象，冰剩芯片cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結果均高于冰凍芯片，差異均有統(tǒng)計學意義（字2=5.738、6.446、5.567、5.584、5.567，P<0.05），見表1。

2.2 術中冰凍切片與術后病理診斷比較 在組織學大小上，術后病理標本共有48例組織學大小≤3 cm，其中38例組織學大小是一致的，符合率為79.17%，組織學大小>3 cm的12例患者，與術后診斷相符者11例，符合率為91.67%。兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.273，P=0.012<0.05），整體符合率為81.67%（49/60）。在腫瘤組織學級別上，術中冰凍與術后石蠟病理總符合率為78.33%（47/60），Ⅰ級符合率為69.23%（9/13），Ⅱ級符合率78.79%（26/33），Ⅲ級符合率為85.71%（12/14）。術中冰凍病理相比于術后石蠟病理組織學級別升高者4例（6.67%），分級下降者9例（15.00%），兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。冰剩組織與術后石蠟病理對比，組織學大小≤3 cm符合率93.75%（45/48），組織學大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學級別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2～5。

3 討論

乳腺癌以浸潤性導管癌居多，在我國婦女中發(fā)病率較高，病死率亦較高。近年來靶向治療在臨床上的發(fā)展較快，且取得較滿意的成效。通過標記免疫組化，將為臨床靶向藥物的選擇、病情的預后判斷和鑒別診斷提供指導。當前國內外以靶向藥物的篩選為主要研究方向，常用的標記物有ER、PR、cerbB-2（her2）、Ki-67、P53等。ER、PR是具有特定功能的蛋白，屬于核受體超家族中的甾體激素受體，對乳腺癌的生長、分化有調節(jié)作用。研究顯示，PR蛋白合成受ER調控，兩者均屬于表面核受體類，當其結合不同的配體后，受體蛋白轉錄活性因子發(fā)揮作用，兩者共同表達時采取輔助內分泌治療往往能夠獲益[6]。對ER（+）和/或PR（+）患者，對雌激素合成進行抑制，阻斷雌激素與ER合成，降低雌激素水平，可抑制激素依賴性腫瘤的細胞生長，從而發(fā)揮治療作用。因而，了解乳腺癌患者ER、PR的陽性表達情況對指導輔助治療有重要意義。

cerbB-2是表皮生長因子受體家族成員之一，具有酪氨酸激酶活性，是185 kD的跨膜糖蛋白，參與多種信號傳導。臨床研究顯示，乳腺癌CerbB-2受體過表達的患者，采取單克隆抗體類藥物Herceptin治療有效，而陰性患者則治療無效，表明其是乳腺癌治療的有效靶點[7]。Ki-67抗原是目前較為肯定的核增殖標志物，其存在于除G0期以外的G1期、S期、G2期及M期。其開始于細胞周期G1期，隨著細胞周期的進展其表達逐漸增加，至M期達峰值，之后逐漸下降，在細胞分裂期很快消失。研究表明，Ki-67表達的高低對研究腫瘤的生物學行為、評價細胞增殖狀態(tài)、判斷其危害性有重要意義，且還可作為乳腺癌化療敏感性指標，相比于腫瘤腫塊的縮小，腫瘤細胞增殖率的降低更能反映腫瘤對化療敏感性[8-10]。P53位于17號染色體短臂上，P53基因突變可能是腫瘤進展惡化的重要因素。研究表明，50%的癌癥患者均有P53基因的突變，乳腺癌P53突變率為20%～60%[11-13]。

目前，靶向治療藥物常常費用昂貴，因而對乳腺癌常見的標記物表達情況進行準確檢測，對乳腺癌術后規(guī)范治療有重要意義[14-17]。術中快速冰凍切片是判斷腫瘤性質的重要方法，能夠為臨床治療提供指導，但術中冰凍片仍存在一定的局限性，如冷凍技術影響切片質量等，而影響檢測結果[18-20]。本研究中通過前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，冰凍芯片與冰剩芯片的cerbB-2蛋白、Ki-67、P53、ER、PR陽性結果比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），以冰剩組織的陽性表達更為明顯。提示快速冰凍技術會影響乳腺癌標記物的陽性表達，原因分析為在快速冷凍的情況下，因溫度在短期內劇烈變化而導致細胞的細胞膜產生跨膜結構破壞，從而影響一些標記物的陽性表達定位，陽性強度減弱，在切片中出現(xiàn)彌散，定位不準確。因而在工作中應盡量避免使用快速冷凍后的樣本進行標記物檢測，盡量選擇冰剩組織進行免疫組織化學染色。同時，本研究中，術中送檢冰凍切片檢查的組織大小及組織學分級與術后石蠟病理結果符合率仍有待提高，進一步提示術中冰凍切片存在一定局限性，易出現(xiàn)漏診及誤診的風險，但冰凍技術具有快捷、高效的優(yōu)點，相比于除石蠟切片診斷以外的其他手段，準確率仍較高。冰剩組織與術后石蠟病理對比，組織學大小≤3 cm符合率93.75%，組織學大小>3 cm符合率100%，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（字2=6.398，P=0.011<0.05），整體符合率為95.00%（57/60）。組織學級別上，整體符合率為91.67%（55/60），與冰凍切片相比差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示冰剩組織可提供更精準的結果。

綜上所述，乳腺癌組織冰凍會影響乳腺癌標記物的陽性表達，建議病理醫(yī)師選擇冰剩組織進行免疫組織化學染色，為患者提供更精準的結果。

參考文獻

[1]唐順莉.影響乳腺癌術中冰凍診斷準確性的病理與臨床因素研究[J].黑龍江醫(yī)學，2014，38（4）：403-404.

[2]霍雷軍，郜紅藝，謝四梅，等.乳腺癌前哨淋巴結活檢的病理特征及意義[J].廣東醫(yī)學，2014，35（19）：3010-3014.

[3]楊海云，劉剛，張林奎，等.乳腺癌患者癌灶動態(tài)增強磁共振成像表現(xiàn)與ER、PR、Akt、p27表達的相關性[J].山東醫(yī)藥，2017，57（23）：69-71.

[4]董永興，孫鵬飛，張永海，等.MR動態(tài)增強血管評分與乳腺癌形態(tài)及部分生物學行為間的相關性探討[J].中國臨床醫(yī)學影像雜志，2016，27（11）：778-780.

[5]王曉燕，李家麗，樊元春，等.影響乳腺癌術中冰凍結果的因素分析[J].成都醫(yī)學院學報，2017，12（4）：473-476.

[6]劉未平，林錦瓊，杜燕，等.多層紙芯片乳腺癌組織微陣列用于抗腫瘤藥物測試[J].分析化學，2016，44（4）：579-585.

[7]王常利.282例乳腺腫塊術中快速冰凍病理診斷分析[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2013，35（9）：1053-1055，封4.

[8]彭妲，白雪蕾，郝力，等.冰凍切片技術診斷乳腺癌腫瘤組織分級準確度及其影響因素分析[J].解放軍預防醫(yī)學雜志，2018，36（2）：237-239.

[9]袁靜萍，陳創(chuàng)，袁修學，等.乳腺癌中VEGF和MMP9的免疫組織化學表達及其與腫瘤轉移復發(fā)的關系[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2016，25（5）：431-436.

[10]潘麗芬，譚淑芳，趙海璇，等.多部門合作優(yōu)化冰凍送檢流程提高乳腺癌保乳手術效率的實踐及效果[J].護理實踐與研究，2017，14（7）：106-107.

[11]龍宇，鄭自通，李一春，等.復方苦參注射液對乳腺癌大鼠的作用[J].中國臨床藥理學雜志，2018，34（2）：141-144.

[12]吳軍，董朝，孫剛，等.維吾爾族婦女早發(fā)性乳腺癌與乳腺癌易感基因1交互作用蛋白1基因多態(tài)性的關系[J].中華實驗外科雜志，2018，35（6）：1005-1008.

[13]寇德強，邱鏡丹，王全勝，等.吲哚菁綠在乳腺癌前哨淋巴結活檢中的應用觀察[J].解放軍醫(yī)學雜志，2015，40（5）：392-395.

[14]葉春梅，高丹，黃自明，等.前哨淋巴結冰凍切片檢查在乳腺癌手術中的應用價值[J].臨床外科雜志，2015，23（10）：763-765.

[15]陳雙龍，付莉，杜好信，等.雄激素受體和NF-κB在乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關系[J].中國老年學雜志，2017，37（9）：2185-2187.

[16] Thakkar A，Wang B，Picon-Ruiz M，et al.Vitamin D and androgen receptor-targeted therapy for triple-negative breast cancer[J].Breast Cancer Research and Treatment，2016，157（1）：77-90.

[17] Chen W，Zhou P，Li X.High expression of DDX20 enhances the proliferation and metastatic potential of prostate cancer cells through the NF-κB pathway[J].International Journal of Molecular Medicine，2016，37（6）：1551-1557

[18]薛林燕，趙旭，才讓卓瑪，等.乳腺癌患者ER、PR、C-erbB-2、Ki-67的表達與超聲征象的關系[J].中國老年學雜志，2018，38（7）：1603-1605.

[19]賈志鶯，艾秀清，張銀華，等.乳腺浸潤性導管癌直接超聲征象與雌激素受體和孕激素受體表達的關系研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，20（27）：3291-3295.

[20]楊良權，周東光，婁歡歡，等.不同分子分型乳腺癌TOPⅡα表達與新輔助化療療效的相關性[J].山東醫(yī)藥，2015，55（43）：78-80.

（收稿日期：2019-03-01） （本文編輯：程旭然）