劉秋玉，劉偉偉，高建東

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎病科 上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腎病研究所 肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海中醫(yī)藥大學(xué))上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(14DZ2273200),上海 201203)

近年來(lái)，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)患病率逐年升高。據(jù)報(bào)道，中國(guó)成人CKD患病率高達(dá)13.4%，極大增加了國(guó)家的醫(yī)療負(fù)擔(dān)[1]。腎纖維化是CKD的標(biāo)志，CKD的嚴(yán)重程度通常與腎纖維化程度相關(guān)[2]。腎纖維化主要包括腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化和腎內(nèi)血管硬化，其病理特征表現(xiàn)為腎臟固有細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肌成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的活化和增殖、細(xì)胞外基質(zhì)(膠原纖維、纖連蛋白、層粘連蛋白)堆積、腎臟固有細(xì)胞丟失、腎小管萎縮塌陷和血管稀疏化，最終導(dǎo)致腎臟正常結(jié)構(gòu)破壞。腎纖維化標(biāo)志著不可逆性腎損傷， 因此早期診斷腎纖維化和針對(duì)病因進(jìn)行治療是延緩CKD進(jìn)展的關(guān)鍵。目前，超聲和磁共振成像等影像學(xué)方法用于評(píng)估CKD患者的腎纖維化，但這些技術(shù)只能從宏觀水平上診斷腎纖維化，無(wú)法敏銳地捕捉腎纖維化炎癥反應(yīng)期的微觀病變信息。而生物標(biāo)志物既能評(píng)估或定量測(cè)量某種疾病的生物學(xué)和病理學(xué)進(jìn)程，同時(shí)也可作為疾病的治療靶點(diǎn)[3]。生物標(biāo)志物參與了疾病進(jìn)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，其水平隨著疾病進(jìn)程的活動(dòng)或進(jìn)展程度而不斷變化。故確定腎纖維化的最佳生物標(biāo)志物，有助于早期準(zhǔn)確診斷腎纖維化和靶向性防治CKD?，F(xiàn)就腎纖維化診斷生物標(biāo)志物研究進(jìn)展予以綜述。

1 腎臟損傷類標(biāo)志物

1.1胱抑素 C(cystatin C，CysC) CysC是分子量為13 000的小分子蛋白質(zhì)，因其分子量小，故可通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)膜。血液中的CysC不易與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，只能通過(guò)腎臟排泄，而腎小管不能直接分泌CysC，CysC經(jīng)腎近曲小管重吸收后被完全代謝分解[4]。CysC是評(píng)價(jià)腎小球?yàn)V過(guò)功能的良好指標(biāo)。許洪濤等[5]提出，CysC不但是一個(gè)能更準(zhǔn)確、更敏感反映早期腎疾病的指標(biāo)，且在CKD早期診斷與分期中具有重要臨床價(jià)值。姚衛(wèi)國(guó)等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在IgA腎病腎小球硬化大鼠模型中，血/尿CysC 水平與腎小球硬化積分和腎小管間質(zhì)纖維化積分呈正相關(guān)，提示血/尿CysC水平可能是反映IgA腎病腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化程度的可靠指標(biāo)。

1.2腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)/甲型肝炎病毒細(xì)胞受體1 KIM-1屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白的一種，其由受損的近端腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)。Zhou等[7]的研究表明，在慶大霉素、汞或鉻誘導(dǎo)的三種急性腎損傷模型中，與其他近端腎小管的毒性生物標(biāo)志物(尿素氮、血肌酐、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶)相比，尿KIM-1具有較高的敏感性和特異性。在臨床研究中，尿KIM-1被證實(shí)是腎小管損傷的早期診斷指標(biāo)[8]。此外，KIM-1主要在炎癥和纖維化區(qū)域內(nèi)的去分化近端腎小管上皮細(xì)胞的腔側(cè)表達(dá)，這意味著KIM-1可能在腎小管間質(zhì)纖維化過(guò)程中起作用[9]。

1.3視黃醇結(jié)合蛋白(retinol-binding protein,RBP) RBP是肝細(xì)胞產(chǎn)生的低分子量蛋白。臨床上，RBP是反映腎近端小管損傷的敏感指標(biāo)，當(dāng)腎近端小管損傷時(shí)，尿中的RBP明顯增多[10]。Pallet等[11]通過(guò)連續(xù)測(cè)量189例腎臟活檢患者尿中的低分子量蛋白(RBP、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白)、高分子量蛋白(白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG)和總蛋白發(fā)現(xiàn)，低分子量蛋白尿水平與腎間質(zhì)纖維化程度呈正相關(guān)，尿RBP與CKD患者的腎間質(zhì)纖維化程度獨(dú)立相關(guān)。因此，臨床可以通過(guò)測(cè)量RBP水平評(píng)估CKD患者的腎間質(zhì)纖維化程度。

1.4中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL) NGAL是分子量為2 500的脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，其在受損的腎小管中高表達(dá)，是急性腎損傷最有效的標(biāo)志物之一。有學(xué)者使用微陣列研究了53個(gè)CKD腎活檢標(biāo)本，并用活檢標(biāo)本的微陣列基因表達(dá)譜來(lái)計(jì)算分子評(píng)分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NGAL和KIM-1等的表達(dá)水平發(fā)生改變，且與腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)[12]。因此，NGAL和KIM-1可作為預(yù)測(cè)腎小管間質(zhì)纖維化和腎小管細(xì)胞損傷的生物標(biāo)志物。

2 炎癥和促纖維化因子類標(biāo)志物

2.1單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1 ,MCP-1) 在腎纖維化早期，炎癥反應(yīng)起至關(guān)重要的作用。炎癥趨化因子，特別是MCP-1，通過(guò)聚集炎癥細(xì)胞，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。MCP-1不但能檢測(cè)狼瘡腎炎中的間質(zhì)炎癥和纖維化[13]，而且在蛋白尿出現(xiàn)之前，可以檢測(cè)1型糖尿病腎病早期病變[14]。此外，尿MCP-1有助于評(píng)估2型糖尿病腎病患者的腎纖維化程度[15]。Mansour等[16]提出，MCP-1與活檢組織中的纖維化有一定的相關(guān)性。研究表明，尿MCP-1可以檢測(cè)到腎功能正常成人早期的腎小管間質(zhì)纖維化[17]。作為隱匿性腎小管間質(zhì)纖維化的生物標(biāo)志物，尿MCP-1對(duì)早期診斷和干預(yù)腎纖維化具有重要意義。

2.2轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)β1TGF-β1是公認(rèn)的纖維化指標(biāo)，其參與了多種進(jìn)行性腎病相關(guān)的腎纖維化和炎癥反應(yīng)。TGF-β1參與腎纖維化主要有以下幾點(diǎn)：①參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)多種炎癥和促纖維化因子。②誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞，刺激成纖維細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。③調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)/金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物1系統(tǒng)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解。當(dāng)發(fā)生腎纖維化時(shí)，組織、血清和尿液中的TGF-β1水平明顯升高。劉江等[18]研究中指出，IgA腎病纖維化患者的尿TGF-β1/肌酐水平與腎小球、腎小管中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原呈顯著正相關(guān)。因此，尿TGF-β1/肌酐可作為腎纖維化活動(dòng)性病變的臨床檢測(cè)指標(biāo)。Kocer等[19]研究證明，在常染色體顯性多囊腎病腎纖維化中，血清TGF-β1水平明顯升高。Musia等[20]的研究顯示，CKD 3～5期患兒血清和尿液中的TGF-β1水平升高。

2.3MMPs/TIMPs MMPs是參與細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的含鋅內(nèi)肽酶，其對(duì)組織發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。最初MMPs被認(rèn)為僅切割細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，但研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附分子(鈣黏素和整聯(lián)蛋白)和生長(zhǎng)因子及其受體等也是MMPs的底物[21]。而TIMPs是結(jié)合和抑制大部分MMPs的內(nèi)源性抑制劑。研究表明，尿液和血清中的TIMP-1、TIMP-2、MMP-1、MMP-2、和MMP-9是腎纖維化的早期生物標(biāo)志物[22-23]。此外，Zhou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，CKD患者的尿MMP-7水平與腎纖維化評(píng)分密切相關(guān)。在MMP-7基因敲除小鼠中，MMP-7的敲除改善了由阻塞性腎損傷誘導(dǎo)的纖維化病變和基質(zhì)基因的表達(dá)[24]。尿MMP-9是反映移植腎早期和長(zhǎng)期功能的生物標(biāo)志物，MMP-9增加與腎小管萎縮和纖維化有關(guān)[25]。在正常情況下，MMPs/TIMPs系統(tǒng)處于穩(wěn)定狀態(tài)，一旦失衡將導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，腎纖維化不可逆轉(zhuǎn)。

2.4人附睪蛋白4 (human epididymis protein 4, HE4) HE4是位于染色體20q12～13.1上的基因編碼的N-糖基化蛋白。它是促進(jìn)腎纖維化的新型成纖維細(xì)胞衍生因子，也是泛絲氨酸蛋白酶、MMP-2和MMP-9的抑制劑。最初HE4被認(rèn)為與精子成熟有關(guān)，后其被作為上皮性卵巢癌患者的血清生物標(biāo)志物。Lebleu等[26]發(fā)現(xiàn)，HE4在人和小鼠腎臟組織中上調(diào)，它通過(guò)抑制絲氨酸蛋白酶35和絲氨酸蛋白酶23來(lái)防止Ⅰ型膠原的降解，促進(jìn)腎纖維化。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，編碼HE4的基因是肌成纖維細(xì)胞中上調(diào)最多的基因，而肌成纖維細(xì)胞是形成腎纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，表明HE4介導(dǎo)了腎纖維化。Wan等[27]發(fā)現(xiàn)，CKD腎纖維化患者早期的血清HE4水平明顯升高，其血清水平與腎纖維化程度相關(guān)，說(shuō)明HE4可作為早期預(yù)測(cè)腎纖維化的標(biāo)志物。

3 微RNAs類生物標(biāo)志物

微RNAs(microRNAs，miRNAs)是約20個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，其在生物體內(nèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制抑制基因表達(dá)。miRNAs在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、器官發(fā)育、干細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移以及免疫系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。其具有組織特異性，并在生物體液中穩(wěn)定存在。腎臟組織中的miRNAs可以用于腎纖維化的組織學(xué)檢測(cè)[28-29]。目前，miRNAs的定性定量檢測(cè)變得相對(duì)容易，故體液中的miRNAs成為無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物的理想來(lái)源。

CKD以腎纖維化為特征，TGF-β1是腎纖維化的關(guān)鍵因子，它能造成細(xì)胞外基質(zhì)的累積并損害正常的腎功能。TGF-β/Smad3通路在組織纖維化中起重要作用，而miRNAs是TGF-β誘導(dǎo)的腎纖維化的核心成員。在腎損傷期間，TGF-β表達(dá)上調(diào)并刺激TGF-β1受體，激活Smad3途徑，從而調(diào)節(jié)腎纖維化中miRNAs的表達(dá)。目前，用于腎纖維化診斷的miRNAs主要有miR-21、miR-29、miR-192和miR-200[30]。

3.1miR-21 TGF-β1通過(guò)Smad3上調(diào)miR-21，miR-21通過(guò)靶向不同的基因來(lái)控制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(膠原蛋白、纖維連接蛋白、上皮鈣黏素和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白)的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)腎纖維化的進(jìn)程。正常腎臟中miR-21低表達(dá)，但在腎臟疾病患者標(biāo)本及CKD和急性腎損傷動(dòng)物模型中，其豐度均大大增加。在梗阻性和糖尿病性腎病小鼠模型中，發(fā)生纖維化的腎小管間質(zhì)和腎小球區(qū)域均觀察到高表達(dá)的miR-21[31-32]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在糖尿病腎病小鼠的腎纖維化中，miR-21通過(guò)增加TIMP-1和減少M(fèi)MP-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積[32]。Liu等[33]認(rèn)為，TGF-β調(diào)控組織腎纖維化的關(guān)鍵為鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽，腎小管上皮細(xì)胞中鞘氨醇激酶/鞘氨醇-1-磷酸鹽與TGF-β活化后的miR-21存在關(guān)聯(lián)，兩者共同影響腎纖維化。Glowacki等[34]首次證明，血清miR-21可作為反映早期腎纖維化的一個(gè)可靠標(biāo)志物。

3.2miR-29 在腎纖維化中，除miR-21外，miR-29家族(miR-29a、miR-29b1、miR-29b2、miR-29c)也廣泛參與了調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生成。miR-29家族對(duì)大量的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因具有靶向作用，從而影響了多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及原纖維蛋白、MMP-2等[35-36]。在高糖培養(yǎng)基中或在TGF-β1誘導(dǎo)下，人腎臟近曲小管上皮細(xì)胞中的miR-29表達(dá)下調(diào)，且有助于多種膠原蛋白基因的表達(dá)。Lv等[37]研究表明，尿外泌體miR-29c可作為CKD患者腎功能和腎纖維化的生物標(biāo)志物。此外有學(xué)者提出，狼瘡性腎炎患者尿外泌體中的miR-29c水平與組織學(xué)慢性指數(shù)和腎小球硬化呈負(fù)相關(guān)[38]。尿miR-29c與腎慢性程度的相關(guān)性，提示其可以用來(lái)反映和早期預(yù)測(cè)組織腎纖維化，是一種新型的非侵入性標(biāo)志物[38]。

3.3miR-192 與其他器官相比，miR-192在正常腎臟中豐度較高[39]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，miR-192通過(guò)調(diào)控E盒結(jié)合鋅指蛋白1/2參與腎小管間質(zhì)纖維化[40]。據(jù)報(bào)道，在阻塞性腎病、IgA腎病和高血壓性腎病引起的腎纖維化中，miR-192的表達(dá)均上調(diào)[41-43]。劉亞楠等[44]的研究表明，miR-192在幼年大鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎所致的腎間質(zhì)纖維化模型中表達(dá)增加，其可能促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的形成。在難治性腎病綜合征患者中，尿miR-192水平有助于判斷腎小球細(xì)胞外基質(zhì)蓄積及腎間質(zhì)纖維化的程度[45]。

3.4miR-200 miR-200家族(miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)通過(guò)抑制E盒結(jié)合鋅指蛋白1/2和TGF-β2來(lái)阻斷 TGF-β介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。在不同的腎纖維化動(dòng)物模型中，miR-200家族的表達(dá)量不相同。有學(xué)者在高血壓性腎小球硬化患者的腎活檢中發(fā)現(xiàn)，miR-200a、miR-200b、miR-141、miR-192、miR-205和miR-429在腎內(nèi)的表達(dá)增加，且其上調(diào)程度與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[43]。有研究表明，無(wú)論導(dǎo)致腎纖維化的是CKD、IgA腎病還是糖尿病腎病，其外泌體miR-200b水平均隨腎纖維化的進(jìn)展而下降，且非近端腎小管來(lái)源的外泌體miR-200b是一種更好的腎纖維化生物標(biāo)志物[46]。

近年來(lái)，新的miRNAs生物標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)。Lv等[47]研究表明，血清中的miR-130b能作為 2型糖尿病腎病腎纖維化的早期診斷標(biāo)志物。石變?nèi)A等[48]的研究顯示，在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型中，miR-207在大鼠纖維化腎組織和尿液中表達(dá)上調(diào)，其為腎臟纖維化的診斷提供新靶點(diǎn)。

4 新型生物標(biāo)志物

尋找可以精確定量腎纖維化的特異性生物標(biāo)志物，有助于開(kāi)發(fā)更有前景的腎纖維化治療方法。目前，已發(fā)現(xiàn)多種潛在的生物標(biāo)志物，但其價(jià)值有待進(jìn)一步研究。B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-3(B-cell lymphoma/leukemia-3,Bcl-3)通過(guò)激活核因子κB通路誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞免疫應(yīng)答和細(xì)胞炎癥反應(yīng)，參與腎臟纖維化。Chen等[49]研究發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻小鼠模型腎組織中的Bcl-3信使RNA和蛋白水平均升高。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，CKD患者血清中的Bcl-3蛋白水平高于正常人，且與血清HE4水平高度相關(guān)。Bcl-3參與腎纖維化的機(jī)制可能為通過(guò)直接與Smad3結(jié)合，并保護(hù)Smad3蛋白免于泛素化和降解來(lái)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[50]。這些證據(jù)表明，Bcl-3可作為檢測(cè)腎纖維化的新型生物標(biāo)志物。李曄等[51]發(fā)現(xiàn)，新纖維化相關(guān)因子表面活性蛋白A2在梗阻性腎組織中高表達(dá)，且隨著腎纖維化程度加重，表面活性蛋白A2的表達(dá)增加，提示表面活性蛋白A2可能參與了腎纖維化過(guò)程。Cho等[52]提出，人類腎臟活檢標(biāo)本中的腎間質(zhì)纖維化及小管萎縮和節(jié)段性腎小球硬化與血清Klotho蛋白水平降低相關(guān)，提示血清和尿Klotho均能預(yù)測(cè)腎纖維化。此外，血清半乳凝素-3、骨膜素、盤(pán)狀結(jié)構(gòu)域受體1、尿波形蛋白信使RNA等也是有廣泛應(yīng)用前景的潛在腎纖維化生物標(biāo)志物。

5 小 結(jié)

CKD多呈隱匿性漸進(jìn)性進(jìn)展，初期癥狀不明顯。目前，評(píng)估和量化腎纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)為腎活檢的病理染色，其中Masson三色染色是臨床診斷腎纖維化的首選方法，但病理學(xué)家主要通過(guò)視覺(jué)評(píng)估Masson三色染色的載玻片進(jìn)行纖維化量化，缺乏對(duì)腎纖維化的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)估，具有很大的主觀性，且Masson三色染色可能對(duì)輕度纖維化不敏感。天狼星紅染色和免疫組織化學(xué)技術(shù)雖能區(qū)分不同類型的膠原纖維，但不能敏感診斷炎癥反應(yīng)期的腎纖維化。而生物標(biāo)志物參與了疾病進(jìn)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，能準(zhǔn)確反映疾病的病理特征，它不僅能作為特異性診斷工具，也是疾病的治療靶點(diǎn)。根據(jù)腎纖維化形成的病理機(jī)制，從患者樣本(組織、血液、尿液)中尋找替代細(xì)胞外基質(zhì)成分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原纖維、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等)的早期生物標(biāo)志物，有助于早期精確診斷腎纖維化和靶向逆轉(zhuǎn)CKD。未來(lái)，借助基因組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等新興技術(shù)，篩選出敏感性、特異性高的腎纖維化診斷標(biāo)志物或聯(lián)合多種標(biāo)志物，有望取代經(jīng)典腎臟病理診斷。