孟祥龍，夏夢，張云青，范廣宇，徐文科，唐秀，段宏安

（連云港出入境檢驗檢疫局，江蘇連云港222042）

隨著人民生活水平的逐步提高，水產(chǎn)品消費占食品消費的比重逐年加大，水產(chǎn)品作為優(yōu)質(zhì)動物蛋白的重要來源和重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品，有效改善了國內(nèi)外消費者的膳食結構，但多年來人民對水產(chǎn)品出口安全關注較多的是獸藥殘留類項目[1-4]，對水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留項目關注則相對較少，中國農(nóng)業(yè)部194 號公告、199號公告等，規(guī)定禁用農(nóng)藥33 種，限用農(nóng)藥17 種。其中，對水產(chǎn)品僅針對六六六和滴滴涕，敵百蟲和溴氰菊設定了限量[5]，其限量標準明顯過少。近年來，輸日泥鰍中硫丹和鰻魚中氟樂靈等農(nóng)藥殘留項目就因被通報而實施了命令檢查[6]。有機氯和菊酯類農(nóng)藥作為高效廣譜的殺蟲劑，化學性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中不易降解、殘留期長，特別是有機氯農(nóng)藥在水和土壤中長期殘留，并可能隨環(huán)境遷移到水生動物體內(nèi)，進而危害人體健康。鑒于此，研究建立快速高效、靈敏度高、應用范圍廣的水產(chǎn)品中有機氯和菊酯類農(nóng)藥等多殘留分析方法十分必要。

當前的農(nóng)殘分析方法主要有氣相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]。氣相色譜法靈敏度高，但抗干擾能力差，氣相色譜-質(zhì)譜法作為一級質(zhì)譜在定性方面比氣相色譜有明顯優(yōu)勢，但色譜柱及隔墊流出物和基質(zhì)碎片離子會干擾測定，而串聯(lián)質(zhì)譜技術通過對一級碎片離子再次打碎，對一級質(zhì)譜無法區(qū)分的化合物可進行進一步的確認[11]。由于水產(chǎn)品中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)等，在用氣相色譜分析時會聚集在氣相色譜進樣口和色譜柱上，造成色譜的分離效率降低，污染儀器[12]，本研究擬用凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）技術在去除大分子的基礎上進一步利用分散固相萃取（dispersive solid-phase extraction，d-SPE）技術，再加入N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）料凈化，以去除有機酸等其他物質(zhì)，分散固相萃取作為具有快速，簡便，低成本、高效的凈化方法，主要用于如蔬菜、水果、高油脂食品類及糧谷等基質(zhì)的檢測[13]，用于水產(chǎn)品中前處理方面研究的也較少[14-15]，本文通過GPC 結合分散固相萃取建立針對水產(chǎn)品中27種有機氯和菊酯農(nóng)藥多殘留分析的樣品檢測方法，通過建立應用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術對水產(chǎn)品中多種農(nóng)藥殘留進行快速篩選、確證及定量的系統(tǒng)分析方法，旨在為進出口及國內(nèi)水產(chǎn)品貿(mào)易及養(yǎng)殖過程監(jiān)測減少檢驗時間、提高檢測效率、降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum XLS 氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國戴安公司；N-EVAPTM 氮氣吹干儀：美國Organomation Associates 公司：GPC ULTRA 凝膠滲透色譜儀：LCtech公司。

乙腈、丙酮、乙酸乙酯均為色譜純：德國默克公司；試驗用水均為超純水：密理博公司；乙酸（分析純）：國藥化學試劑公司；農(nóng)藥標準品：德國Dr 公司或農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所；PSA 固相萃取吸附劑：安捷倫公司。

農(nóng)殘標準品（固體標準品）：德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度均大于90%；液體標準品：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所，濃度為100 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取固體標準品適量用丙酮定容，得濃度為500 μg/mL 的混合標準儲備液I，再稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的混合標準儲備液Ⅱ，準確量取1 mL 標準儲備液Ⅱ和購買的100 μg/mL 的液體標準溶液置于同一只50 mL 容量瓶中，用丙酮稀釋定容，再逐級稀釋后得質(zhì)量濃度均為1 μg/mL 的27 種農(nóng)藥的混合標準儲備液，所有的儲備液均于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

其中配制的500 μg/mL 的儲備液I 保存期為6 個月，外購的濃度為100 μg/mL 的標準溶液有效期根據(jù)證書均為12 個月，其他混合標準溶液保存期為20 d，使用前恢復至25 ℃。

1.2.2 儀器工作條件

色譜柱：HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱溫條件：初始溫度50 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升至 150 ℃，以 3 ℃/min 升至 230 ℃，再以10 ℃/min 升至 290 ℃，保持 3 min；載氣：高純氦氣，流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL ；進樣模式：不分流進樣；輔助傳輸線溫度：290 ℃。

離子源溫度：250 ℃；發(fā)射電流：50 μA；離子源：EI源；分析模式：多反應監(jiān)測；碰撞氣壓力：0.159 6 Pa（Ar）；溶劑延遲：4 min；每種農(nóng)藥化合物離子掃描參數(shù)詳見表1。

1.2.3 試驗步驟

樣品提取部分：稱取攪碎后的水產(chǎn)品肌肉組織樣品10.0 g 放入50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 0.1%乙酸乙腈，超聲30 min 后，加入5.0 g NaCl 振蕩鹽析10 min，以 3 500 r/min 離心 5 min，準確移取 10 mL 上層清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用 10 mL 環(huán)乙烷-乙酸乙酯（1 ∶1）復溶，超聲 5 min，過 0.22 μm 濾膜于 60 mL GPC 進樣瓶里，待凈化。

樣品凈化部分：以Bio-Beads SX3 凝膠作為柱填料，環(huán)己烷-乙酸乙酯（1 ∶1）作為流動相，柱流速5 mL/min，樣品定量環(huán)5 mL，收集1 200 s～1 800 s 的流出液，將收集的餾分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用乙腈定容至1 mL，加入0.1 g PSA 固相萃取吸附劑后旋渦30 s，以3 500 r/min離心5 min，過0.22 μm 濾膜，用于氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatography-triple quadrupole-tardem mass spectrometry，GC-MS/MS）檢測。

2 結果與分析

2.1 溶劑的優(yōu)化

常采用的提取溶劑有丙酮、乙腈、乙酸乙酯等。但相比較乙腈，丙酮與乙酸乙酯萃取液顏色明顯較深，共萃取物較多，而乙腈的優(yōu)點在于，樣品中的大多數(shù)親脂性物質(zhì)都不能被萃取，萃取液中僅含有少量的共萃取物[16]，對農(nóng)藥的溶解度較大，且分子小，組織穿透能力強，由于大多數(shù)農(nóng)藥在酸性條件下較為穩(wěn)定，在乙腈中加入少量的乙酸可有利于農(nóng)藥殘留物的定量提取，本文分別比較了乙酸乙酯、丙酮、乙腈、0.1%乙酸乙腈的提取效果，試驗結果見圖1。

圖1 27 種農(nóng)藥在4 種提取溶劑中的提取效果Fig.1 Extraction results of 27 pesticides in four solvents

如圖1可知，0.1%乙酸乙腈作為提取溶劑時，回收率在70%～110%之間的項目最多，可能是在乙腈提取液中加入0.1%乙酸可以對農(nóng)藥起到穩(wěn)定作用，所以選用0.1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 GPC時間參數(shù)的優(yōu)化

使用GPC 可有效去除油脂、類脂化合物、聚合物、蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)，為考察GPC 對水產(chǎn)品的凈化效果，本研究采用分段收集法，從800 s 開始，每100 s 收集一段流出組分，通過GC-MS/MS 對其行進行評價，以累積回收率為縱坐標，流出時間為橫坐標，制作流出曲線見圖2。

圖2 27 種農(nóng)藥GPC 流出時間和累積回收率流出曲線Fig.2 Relationship between GPC elution times and cumulative recoveries of the 27 pesticides

由圖2可知，從1 100 s 開始有聯(lián)苯菊酯等農(nóng)藥成分流出，到1 800 s 所有化合物流出，由于到1 200 s 時油脂組分已基本無流出，綜合考慮回收率和凈化效果，收集1 200 s 和1 800 s 之間的流出組分。

2.3 固相萃取吸附劑用量的優(yōu)化

經(jīng)過GPC 除脂后的樣品可能含有少量的雜質(zhì)，因而加入PSA 填料可對樣品進一步進行分散固相萃取凈化，以除去殘留的強極性雜質(zhì)和色素等。這里以陰性泥鰍基質(zhì)為研究對象，按照1.2.2 步驟處理4 份泥鰍陰性空白基質(zhì)，PSA 吸附劑加入量分別為0.05、0.1、0.15、0.2 g，處理后的樣品用GC-MS/MS 上機采集質(zhì)譜多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）色譜圖，并比較色譜圖差異，見圖3。

圖3 泥鰍空白樣品經(jīng)不同PSA 吸附劑加入量凈化后的MRM 色譜圖Fig.3 MRM chromatogram of blank loach after purifytion with PSA adsorbents of different amount

由圖3可知，在加入0.1PSA 固相萃取吸附劑后，再增加PSA 吸附劑用量，MRM 圖譜沒有顯著變化，說明干擾物質(zhì)在加入0.1PSA 吸附劑后已基本去除，故加入0.1PSA 吸附劑就達到了凈化泥鰍空白樣品的目的，所以PSA 吸附劑用量定為0.1 g。

2.4 儀器條件的優(yōu)化

選擇合適濃度的農(nóng)藥混合標準溶液進行單機質(zhì)譜全掃描并結合譜庫尋找確定每種農(nóng)藥保留時間及特征母離子；根據(jù)母離子碎片和保留時間合理分組來優(yōu)化碰撞能量，在優(yōu)化的碰撞能量下對母離子進一步碰撞解離，選擇靈敏度較大的兩組離子對，分別做定量和定性用，27 種農(nóng)藥的監(jiān)測離子對見表1。

2.5 基質(zhì)效應考察及消除

為了消除基質(zhì)效應，保證檢測結果的準確性，采用空白泥鰍配制一系列基質(zhì)標準工作溶液。選用陰性泥鰍樣品按1.2.2 的試驗步驟提取后，得到空白樣品提取液，用此空白基質(zhì)液將27 種混合標準溶液分別稀釋成一系列基質(zhì)標準工作溶液，按優(yōu)化好的GC-MS/MS條件進行是試驗，在 20、50、100、200、400 μg/L 濃度內(nèi)以各待測物的定量離子譜峰面積（y）對其在溶液中的含量（x，μg/L）進行線性回歸計算，繪制標準曲線，采用外標法定量，所有項目標準曲線的線性相關系數(shù)都大于 0.99，所以基質(zhì)標液的線性范圍為：20 μg/L～400 μg/L，分別以每種農(nóng)藥3、10 倍信噪比計算檢出限和定量限，具體信息見表1。

表1 27 種農(nóng)藥監(jiān)測離子對、碰撞能量、相關系數(shù)、檢出限、定量限、回收率、相對標準偏差Table 1 Monitoring ion pairs，collision energies，R2，limits of detection，limits of quantitation recoveries and relative standard deviations of 27 pesticides

續(xù)表1 27 種農(nóng)藥監(jiān)測離子對、碰撞能量、相關系數(shù)、檢出限、定量限、回收率、相對標準偏差Continue table 1 Monitoring ion pairs，collision energies，R2，limits of detection，limits of quantitation recoveries and relative standard deviations of 27 pesticides

2.6 方法的回收率、精密度

按照1.2 節(jié)方法，采用空白泥鰍樣品進行加標回收試驗，添加濃度分別為 10、20、100 μg/kg，每個添加水平處理6 個平行樣，計算農(nóng)藥平均回收率和相對標準偏差，以考察方法的準確性和精密度，27 種農(nóng)藥的回收率在60.5%～118%之間，相對標準偏差在0.75%～15%之間，結果見表1。

2.7 實際樣品的檢測

分別取陰性的泥鰍樣品利用本研究建立的分析方法檢測30 批實際樣品，其中在1 批泥鰍樣品中分別檢出硫丹硫酸鹽，檢出含量分別為4.19 μg/kg，其他樣品中均無農(nóng)藥殘留檢出。

3 結論

本研究將凝膠滲透色譜儀凈化與分散固相萃取技術結合，通過對提取溶劑的優(yōu)化，凝膠滲透色譜儀收集時間、分散固相萃取凈化及儀器條件的系統(tǒng)優(yōu)化過程，建立了利用三重四級桿氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測泥鰍中27 種有機氯和菊酯農(nóng)藥殘留的方法，該方法穩(wěn)定可靠，抗干擾能力強，方法的相關指標滿足實際檢測需求，可用于進出口及國內(nèi)貿(mào)易中泥鰍等水產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留的檢測。