王春艷，聶緒恒，袁毅，蔣雁，向西

（1.貴州省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.云南省糧油科學(xué)研究院，云南 昆明 650000）

黃曲霉毒素可以由黃曲霉、寄生曲霉、集峰曲霉和偽溜曲霉4 種曲霉菌產(chǎn)生，是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生化合物[1]。黃曲霉毒素B1是已知的最強(qiáng)致癌物之一[2-3]，對(duì)人和動(dòng)物具有極強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用，并且對(duì)肝臟的急性毒性也很高[2-7]。糧食在種植、收獲、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過程中如保存不當(dāng)極易受潮霉變而污染黃曲霉毒素[8]。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》[9]對(duì)食品中真菌毒素已明確限量規(guī)定。

不確定度是表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性，與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)[10]。一個(gè)完整的定量分析結(jié)果應(yīng)該包含測(cè)量值（表示被測(cè)量集中性的參數(shù)又稱最優(yōu)估計(jì)值）和測(cè)量不確定度（表示被測(cè)量分散性的參數(shù)）兩個(gè)指標(biāo)[11-13]。不確定度是對(duì)測(cè)量結(jié)果質(zhì)量的定量評(píng)定，測(cè)量結(jié)果是否有用，很大程度上取決于不確定度的大小，所以測(cè)量結(jié)果必須有不確定度說明時(shí)才是完整和有意義的[14]。目前，已有大量的研究文獻(xiàn)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定食品中常見的真菌毒素不確定度進(jìn)行評(píng)定[15-20]，而采用超高效液相色譜法-無衍生器（大流通池直接檢測(cè)）-熒光檢測(cè)器測(cè)定糧食中真菌毒素不確定度評(píng)定的文獻(xiàn)資料較少，試驗(yàn)采用GB 5009.22-2016[21]《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B 和G 族的測(cè)定》測(cè)定玉米中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的含量，根據(jù)JJF1059.1-2012[11]《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》要求及CNAS-GL006-2018[10]《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》，評(píng)定試驗(yàn)過程引入的不確定度，對(duì)測(cè)定過程中產(chǎn)生的不確定度分量進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算出合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及各分量的相對(duì)貢獻(xiàn)[8]，以期為評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米樣品：貴州省儲(chǔ)備糧管理有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：1162-65-8，純度 99%，25.01μg/mL，不確定度為±0.03 μg/mL）：新加坡 Pribolab 公司；甲醇、乙腈均為色譜純：美國(guó)Tedia 公司；AFB1免疫親和柱：江蘇蘇微生物研究有限公司；玻璃纖維濾紙：英國(guó)Whatman 公司；屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀（配大體積流通池?zé)晒鈾z測(cè)器）：美國(guó)Waters 公司；LT202E型分析天平：常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司；HY-4 型多用調(diào)速振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；N-EVAP111 型氮吹儀：美國(guó)Organomation 公司；S0200 漩渦振蕩器：美國(guó)萊伯特公司；3310 型實(shí)驗(yàn)?zāi)ィ喝鸬?Perten 公司；Researchplus 手動(dòng)移液器：德國(guó)eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

參照GB5009.22-2016[21]“第三法高效液相色譜-柱后衍生法”大流通池直接檢測(cè)，并結(jié)合江蘇蘇微生物研究有限公司提供的黃曲霉毒素B1免疫親和柱說明書進(jìn)行：將玉米樣品清雜后，磨粉機(jī)粉碎，準(zhǔn)確稱取5.00 g 試樣于150 mL 具塞錐形瓶中，加入1.0 g 氯化鈉及25 mL 70%的甲醇水溶液，振蕩20 min，用快速定性濾紙過濾，移取15 mL 濾液，用30 mL 水將濾液稀釋混勻，再經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；移取15 mL 上樣液過免疫親和柱，用去離子水淋洗免疫親和柱2 次，每次10 mL，待液體排干后，用1.5 mL 甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑贸跏剂鲃?dòng)相復(fù)溶定容至1.5 mL，用 0.22 μm 微孔濾膜，待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫 35 ℃；流動(dòng)相：A 為水，B 為乙腈-甲醇（50+50）；等度洗脫：洗脫程序?yàn)?65%A，洗脫時(shí)間 6 min；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)：365 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：436 nm。

1.3.3 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)定原理及方法，樣品中AFB1含量計(jì)算見公式[21]（1）：

式中：X 為樣品中 AFB1含量，μg/kg；C 為試樣中AFB1含量，ng/mL；V 為最終甲醇洗脫液體積，mL；W為最終凈化洗脫液所含試樣質(zhì)量，g；m 為試樣稱取質(zhì)量，g；V1為樣品和提取液總體積，mL；V2為稀釋用樣品濾液體積，mL；V3為稀釋液體積，mL；V4為通過親和柱的樣品提取液體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

根據(jù)[10-11]CNAS-GL006-2018《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》、JJF1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，從試樣的檢測(cè)過程及數(shù)學(xué)模型分析，玉米中AFB1測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來源有：1）玉米樣品非均勻性因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（fhom）；2）AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)過程帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（cal），包括標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（cs），標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Cs 由溫度變動(dòng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（C），標(biāo)準(zhǔn)中間液配置urel（V1）和urel（V2）、標(biāo)準(zhǔn)工作液配置引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（Vs）；標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（c）；3）玉米樣品稱量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定urel（m）；4）回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度玉米樣品處理液定容引入的不確定度urel（V）；6）AFB1含量重復(fù)性測(cè)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ωrep）。根據(jù)JJF1059.1-2012[11]，將各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行合成，得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式（2）：

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 由樣品非均勻性因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（fhom）

由于玉米顆粒較小麥、稻谷大，AFB1在試樣不同籽粒間分布極不均一，通常只有少部分顆粒受到黃曲霉菌污染，但經(jīng)染的籽粒上卻有較高的AFB1含量，所以感染嚴(yán)重的籽粒通常可以左右測(cè)定結(jié)果[22-23]，因此樣品非均勻性引入的不確定度分量應(yīng)該包含在被測(cè)量的計(jì)算公式中。為了保證試樣均勻性和檢測(cè)結(jié)果的代表性，需要大量取樣以制備樣品，主要過程包括混合、粉碎、混勻、縮分等[23-24]。本試驗(yàn)制樣過程如下：1）將待檢測(cè)原糧樣品（約2 kg）至于鐘鼎式分樣器反復(fù)混勻分樣10 次；2）分別將單側(cè)1/2 樣（約1 kg）再次經(jīng)鐘鼎式分樣器反復(fù)混勻5 次；3）隨機(jī)分別取兩側(cè)1/4 樣（約0.5 kg）經(jīng)鐘鼎式分樣器分樣，得到1/8 樣（約0.25 kg）；4）隨機(jī)取兩測(cè)1/8 樣混合，得到約500 g試樣，經(jīng)波通水分磨粉碎，裝入比試樣體積大3 倍的自封袋，將自封袋充滿空氣封口合上，手動(dòng)上下左右搖勻約1 min，即得到待測(cè)玉米粉試樣。為了評(píng)定該不確定度分量，本試驗(yàn)從待測(cè)玉米粉試樣平行稱取10 份樣品，分別測(cè)定含量，測(cè)定結(jié)果見表1，其不確定度按A類評(píng)定。

表1 不同樣品AFB1 含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Analytical results for the determination of AFB1 in different samples

10 個(gè)試樣測(cè)定結(jié)果平均值X=3.60 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差

因此，含量平均值X 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel（fhom）=

2.2.2 校準(zhǔn)不確定度

校準(zhǔn)過程中的不確定度包含兩種不確定因素：一是標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，二是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

1）不同廠家生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度不同，由其所導(dǎo)致的不確定度也不同，查找AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出廠證書可以知道其濃度為（25.01±0.03）μg/mL，置信水平為95%，按B 類評(píng)定，屬于正態(tài)分布，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u（cs）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（cs）分別為

2）標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度Cs 由溫度變動(dòng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液的溶劑為乙腈，20 ℃時(shí)乙腈的膨脹系數(shù)為 1.37×10-3℃-1，而實(shí)驗(yàn)室的溫度為（20±5）℃，按B 類評(píng)定，服從均勻分布，包含因子區(qū)間半寬度為：α（Cs）=5 ℃×1.37×10-3℃-1=6.85×10-3，引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3）中間標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：吸取400 μL 黃曲霉毒素 B1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（25.01±0.03）μg/mL，用初始流動(dòng)相定容到10mL 容量瓶，得到濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制過程中使用移液器吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液時(shí)，會(huì)引入一定的不確定度，依據(jù)JJG 646-2006[25]移液器檢定規(guī)程中相應(yīng)的最大允差（maximum permissible errors，MPE），并根據(jù)矩形分布計(jì)算可以得到

同樣可以根據(jù)JJG 196-2006[26]規(guī)程得到，配制過程中使用的 10 mL 容量瓶的允差為±0.020 mL，u（V2）和urel（V2）分別為

4）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：把黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)中間液1 μg/mL 用初始流動(dòng)相稀釋得到 0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL 的校準(zhǔn)曲線溶液。配制過程中使用了大小不同的移液器，由此產(chǎn)生的不確定度如表2所示，依據(jù)JJG 646-2006[25]移液器檢定規(guī)程中應(yīng)的MPE，計(jì)算得到：

綜上可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制帶入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表2 使用不同量程移液器時(shí)的不確定度Table 2 Uncertainty in the use of different range pipettes

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品中AFB1濃度測(cè)定過程采用所配制的0.1、0.5、2、5、10、20 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別取以上 6 種不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 uL 重復(fù)測(cè)定3 次，得到3次對(duì)應(yīng)的峰面積A1～A3，根據(jù)最小二乘法計(jì)算，通過Excel 軟件擬合，求得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的一元一次方程A=129 055.5C+8 152.7，結(jié)果見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果Table 3 Calibration curve fitting

將得到的6 次樣品峰面積值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，求得6 次測(cè)定的平均濃度C=3.74 ng/mL，樣品中AFB1的濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，而標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程中存在著一定的不確定度，其u（c）值為u（c）=式中：s（A）表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差7 419；A 表示標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積；C 表示標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；表示標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度ng/mL；Sss表示標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和表示標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，本試驗(yàn)取n=18；P 表示試樣的測(cè)定次數(shù)，本試驗(yàn)取P=3。標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合過程中存在的urel（c）值為：

綜上所述，校準(zhǔn)過程帶入的不確定度為：

2.2.3 樣品稱量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定

用精確至0.01 g 的電子分析天平稱取玉米樣品，稱量過程所引入的不確定度來自天平校準(zhǔn)。天平校準(zhǔn)的允許誤差極值為±0.01 g，不確定度按B 類評(píng)定，服從均勻分布，包含因子稱樣量為5.00 g，則稱量樣品時(shí)天平引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.4 回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

玉米試樣的前處理包括提取溶劑萃取、過濾、稀釋、凈化、濃縮、復(fù)溶等步驟，不確定度的影響因素較多，各環(huán)節(jié)的不確定度難以評(píng)定，該不確定度屬A 類評(píng)定，利用添加3.0 ug/kg 水平6 次樣品進(jìn)行平行加標(biāo)測(cè)定，測(cè)定的Rec 分別為92.0%、93.5%、89.5%、94.0%、95.0%、94.5%。平均回收率=93.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SR=2.04%，計(jì)算得到分別為：

2.2.5 樣品處理液定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)JJG 646-2006[25]，5 mL 移液器允許最大誤差為±1.0%，按B 類評(píng)定，屬于均勻分布則5 mL移液器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.6 AFB1含量測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ωrep）

重復(fù)性引入的不確定度，主要受操作人員的熟練程度及儀器本身性能等因素的影響，并包含了C、V、m測(cè)量時(shí)的重復(fù)性不確定度的分量，該不確定度屬A 類評(píng)定[24]。隨機(jī)選取2.2.1 節(jié)中AFB1試樣1 進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)測(cè)定，結(jié)果分別為 3.78、3.82、3.80、3.82、3.79、3.79 μg/kg，平均值=3.79 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算測(cè)定過程中伴隨的隨機(jī)效應(yīng)導(dǎo)致的和urel（ωrep）分別為

2.3 相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由上述各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成玉米中AFB1含量測(cè)定的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 主要相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量對(duì)相對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)

主要相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量對(duì)相對(duì)合成不確定度的貢獻(xiàn)見表4。

表4 主要不確定度分量的相對(duì)貢獻(xiàn)Table 4 The relative contribution of uncertainty components

由表4可知，樣品非均勻性引入的不確定度相對(duì)貢獻(xiàn)最大，回收率、校準(zhǔn)過程、樣品處理液定容等次之，樣品稱量及重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)貢獻(xiàn)最小。

2.5 相對(duì)擴(kuò)展不確定度

試驗(yàn)玉米中AFB1的含量為3.60 μg/kg，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

在沒有特殊要求的情況下，按照國(guó)際慣例，取擴(kuò)展因子k=2，置信概率p=95%，則AFB1測(cè)量結(jié)果的相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

因此，高效液相色譜法測(cè)定玉米中AFB1含量測(cè)量結(jié)果可表示為（3.60±0.14）μg/kg，包含因子 k=2，置信概率p=95%。

2.6 討論

從表4各主要不確定度分量的相對(duì)貢獻(xiàn)可知，試驗(yàn)過程中樣品均勻性所引入的不確定度分量（52.08%）最大，黃曲霉毒素B1在樣品中分布不均勻性問題已是客觀存在，提示檢測(cè)人員在實(shí)際工作中，應(yīng)該重視真菌毒素的混樣、取樣步驟，同時(shí)扦樣人員在入庫(kù)扦樣時(shí)應(yīng)注意所扦樣品是否具有代表性，扦樣點(diǎn)少無代表性，扦樣點(diǎn)多增加工作人力，且耗時(shí)，對(duì)于不同大小糧倉(cāng)，應(yīng)扦取多少個(gè)樣品點(diǎn)，還有待深入研究。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用超高效液相色譜法測(cè)定玉米中AFB1的含量，通過分析和量化各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，并對(duì)測(cè)定結(jié)果的不確定度來源和各分量相對(duì)貢獻(xiàn)進(jìn)行比較，得出如下結(jié)論。

1）通過計(jì)算各分量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到各分量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得知玉米中AFB1不確定度主要來源于樣品非均勻性，其次是樣品前處理回收率、校準(zhǔn)過程及樣品處理液的定容，樣品稱量及重復(fù)測(cè)定引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度貢獻(xiàn)最小。

2）試驗(yàn)結(jié)果的不確定度可表示為（3.60±0.14）μg/kg。在測(cè)定過程中，由于真菌毒素在樣品中分布極不均。因此，在樣品制備過程中，顆粒樣品的粉碎和進(jìn)一步混勻至關(guān)重要，檢測(cè)為了使檢測(cè)結(jié)果客觀、真實(shí)，檢測(cè)人員應(yīng)多次混勻樣品，平行測(cè)定2 個(gè)以上樣品，盡量減小由樣品不均勻因素引入的不確定度；同時(shí)，檢測(cè)人員應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，定期做加標(biāo)回收試驗(yàn)，或?qū)|(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)試，盡可能減少系統(tǒng)和偶然誤差；并定期參加不同單位間的能力比對(duì)驗(yàn)證活動(dòng)，發(fā)現(xiàn)新問題，解決問題，只有這樣，才能把不確定度控制在可接受的范圍內(nèi)。