劉涵玉，何臘平，2，*，李翠芹，陳翠翠，鄭佳，朱秋勁，2，陶菡，2

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省農畜產品貯藏與加工重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學化學與化工學院，貴州 貴陽 550025）

牛干巴屬于干腌牛肉這一大類產品，是我國云貴川特色臘牛肉制品，具有風味獨特、味道鮮美、食而不膩等特點[1]。風味決定了消費者對產品的可接受程度。不同地區(qū)的牛干巴因其加工工藝、制作原料、氣候等因素的不同，形成了不同的風味特征。已有學者對云南、新疆等地的牛干巴揮發(fā)性風味成分進行研究[2-3]。沙坤等[2]指出云南黃牛和牦牛干巴分別由50 種和42種揮發(fā)性風味成分，并且確定了新疆不同地區(qū)的風干牛肉樣品特征性香氣成分：己烷、2-戊基-呋喃、1-辛烯-3-醇和部分醛類。Kaban 等[4]報道了土耳其干腌牛肉中檢測出48 種揮發(fā)性風味成分，芳樟烴類是含量最豐富的化合物。但針對貴州牛干巴研究還未見報道。因此有必要對貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分進行研究。

目前對牛干巴菌群結構的研究還是最傳統(tǒng)的分離方法，由于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的局限性，使其不能全面真實反應牛干巴中微生物的群落組成。因此有必要采用當前較先進成熟，價格適當?shù)膇llumina MiSeq 第二代高通量測序平臺。

本試驗以貴州市售牛干巴為材料，采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯(lián)用儀對其揮發(fā)性成分進行分析并結合主成分分析，找到貴州牛干巴的風味成分的組成，同時結合illumina MiSeq 第二代高通量測序平臺，評估牛干巴中細菌群落結構和多樣性；在此基礎上進一步分析牛干巴中風味品質與細菌群落多樣性之間的關系，為牛干巴產品的風味品質評價，加深對牛干巴發(fā)酵機制的認識，以及生產工藝的優(yōu)化提供科學依據(jù)。

1 方法與材料

1.1 材料與試劑

試驗所用3 組貴州干巴（真空包裝）購于貴州興義農貿市場，樣品編號分別為：牛干巴1、2、3 號。樣品購買后切分成小塊，真空包裝，并儲存于于-80 ℃冷凍冰箱中備用。

正構烷烴（色譜純）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-7000B 氣-質聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司；DB-WAX 型色譜柱（250 μm × 0.25 μm，30 m）：美國 J＆W Scientific 公司；固相微萃取裝置（50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭）：美國Supelco 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 感官評定

感官評定參照高月娥等[5]的方法。由10 位專家組成的評價小組分別從色澤、口感、氣味、滋味和組織狀態(tài)5 個方面對牛干巴進行感官分析。

1.3.2 揮發(fā)性風味成分的測定

頂空固相微萃取條件：稱取3 g 肉樣切碎成肉末，放入20 mL 萃取瓶，密封，50℃條件下平衡20 min。插入50/30 μm CAR/DVB/PDMS 固相微萃取頭進行吸附40 min。轉移插入氣相色譜質譜儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進樣口，在 250 ℃溫度下解析7 min，同時啟動儀器采集數(shù)。

氣譜條件：毛細管柱為DB-WAX 柱（250 μm×0.25 μm，30 m），程序升溫：起始溫度 40 ℃，保持 3 min；然后5 ℃/min 的速度升溫到150 ℃，保持1 min；再以3 ℃/min 的速度升溫到200 ℃，保持1 min；最后以5 ℃/min 的速度升溫到230 ℃，保持3 min。氣化室溫度250 ℃；載氣為 N2，流速 6 mL/min，分流比 5 ∶1。

質譜條件：電子電離源，電子能量70 eV，接口溫度250 ℃，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度280 ℃。

定性定量分析：對總離子流圖中的各峰采用Nist2005 和Wiley275 普庫檢索，取匹配度70 %以上，初步確定牛干巴的揮發(fā)性成分，再結合標準系列烷烴（C7～C40）在相同氣質條件下，根據(jù)保留時間，分別計算不同物質的保留指數(shù)（retention indices，RI），再結合網站www.odour.org.uk 上的RI 值進行化合物的鑒定。計算公式如下：

式中：TR（x）為待測組分保留時間，min；TR（z+1）為碳數(shù)為Z、Z+1 正構烷的保留時間，min；且TR（z）

定量分析：采用峰面積歸一化法確定各化學成分的相對含量。

主成分分析：對3 種牛干巴樣品相對含量大于0.05 的揮發(fā)性成分借助SPSS 20.0 進行主成分析。

1.3.3 高通量測序

3 種牛干巴樣品送北京百邁克生物科技有限公司，提取DNA 后，進行擴增細菌16S V3-V4 區(qū)并對其產物進行處理形成測序文庫，質檢合格后，可用Illumina HiSeq 2500 進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件對相關數(shù)據(jù)進行方差分析（Duncan 法）。

2 結果與分析

2.1 感官評價

貴州牛干巴感官評價結果見表1。

表1 貴州牛干巴感官評價得分Table 1 Sensory evaluation score of Guizhou Niuganba

1 號和3 號牛干巴色澤最好，切面呈玫瑰紅，有光澤，感官評分顯著高于 2 號牛干巴（P＜0.05），2 號牛干巴切面脂肪偏黃，色澤深暗，并且口感方面較為綿軟，咀嚼缺乏韌勁，因此口感感官評分也較低。但是2 號牛干巴氣味、滋味和組織形態(tài)得分均高于1 號和3 號牛干巴（P＜0.05），擁有牛干巴專有香氣，氣味濃郁，香味純正，整體風味比例恰當，切面均勻光滑，組織紋理清晰。而1 號和2 號牛干巴中辛香料味道過重，掩蓋了原本牛干巴的特有香氣，整體風味不協(xié)調。

2.2 貴州牛干巴揮發(fā)性風味物質研究

貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分的定性和定量分析結果見表2。

表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分的定性和定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

續(xù)表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

續(xù)表2 貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分的定性和定量分析Continue table 2 Qualitative and quantitative analyses of volatile compounds detected in Guizhou Niuganba

烴類是3 組牛干巴中檢測種類最多的化學類別，共有 25 種，1 號牛干巴有 17 種（7.62%），2 號牛干巴11 種（50.8%），3 號牛干巴（12.62%）。烯烴類化合物種類相對較多，原因可能與加入的辛香料有關。這類烯烴氣味強烈，閾值較低[6]，對貴州牛干巴的風味有重要貢獻。如α-姜黃烯則存在于干姜等植物中[7]氣味濃郁芳香。辛香料物質香氣柔和，風味醇香，可同其他揮發(fā)性成分一起賦予牛干巴清香獨特的風味[8]?？梢娦料懔咸砑拥姆N類和含量對貴州牛干巴揮發(fā)性風味成分有比較大的影響。

本試驗共鑒定出14 種醛類化合物，它是牛肉主要揮發(fā)性風味物質。1 號牛干巴含有12 種醛類（3.7%），3號牛干巴含有6 種2.46%），2 號牛干巴含有4 種，雖然數(shù)量最少，但是含量都高于另外兩組。醛類主要來自于脂肪氧化和斯特雷克爾（strecker）氨基酸反應[9]。這些醛類當中，直鏈脂肪醛、烯醛是典型的脂肪氧化的產物[10]，檢測到的戊醛、己醛、（E）-2-庚烯醛可能源于不飽和脂肪酸的氧化作用[11]。而氨基酸的strecker 降解可以形成支鏈醛，如苯甲醛、苯乙醛等[12-13]。醛類由于香氣閾值一般較低，且具有薄荷味[14]、清香和油脂香氣味特征，對干腌肉制品的風味形成有重要貢獻，是肉類風味品質的重要評價標準之一[15]，常被認為對不同種肉的特征香氣有貢獻[16-17]。

醇類一般來源于微生物代謝（苯乙醇等支鏈醇）、脂肪氧化或者是羰基化合物還原生成，還有一部分來自辛香料中[18]，比如，桉葉油醇、芳樟醇、4-松油烯醇。此外，3 組牛干巴中均檢測出芳樟醇，1 號和3 號樣品中的含量分別高達75.72%和75.84%，是含量最高的揮發(fā)性風味成分，但2 號含量只有15.93 1%，而這1、3號感官得分相近，說明芳樟醇對1、3 貴州牛干巴的風味成分具有較大貢獻。

鑒定醇酮類5 種，在3 組牛干巴中均含有乙偶姻、花椒素，除乙偶姻來源于美拉德反應中糖降解反應外，其他4 種均來源于辛香料的添加。

另外還檢測出6 種其他類化合物。3 種牛干巴中均檢測出乙酸乙酯、乙酸和2，3，5，6-四甲基吡嗪，乳酸菌通過糖代謝生成乙酰磷酸，在乙酸激酶作用下可產生乙酸[19]。而微生物的酯化作用，可以使羧酸與醇類反應生成酯類，酯類化合物對于食品風味的貢獻很大。3 組樣品中檢測到了乙酸乙酯和丁酸芳樟酯。具有特殊香味的雜環(huán)化合物和硫醚類化合物，分別來源于美拉德反應和硫醇類化合物反應[20]。

通過這3 組貴州牛干巴樣品的揮發(fā)性風味成分進行分析，與其他地區(qū)牛干巴產品比較，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性成分在種類與含量組成方面是有差異的。W?sierska等[21]，Kaban 等[4]發(fā)現(xiàn)，微生物代謝作用也會形成干腌牛肉風味，例如：3-甲基-1-丁醇，乙酸乙酯，己酸乙酯等。然而通過分析貴州牛干巴風味物質的來源，推測可知，辛香料的添加、氨基酸的strecker 反應、脂肪氧化和微生物代謝作用是形成貴州牛干巴獨特風味物質的重要途徑。其風味成分以萜烯類、醇類和醛類為主，其中烴類物質種類最多，醇類物質含量最高（除2號樣品）。這樣的成分組成明顯區(qū)別于其他地區(qū)牛干巴：伊犁風干牛肉以酚類物質為主，其次是烴類和醇類；塔城風干牛肉中，則是醛類物質含量最高，再以醇類和烴類為其次風味物質；在阿勒泰風干牛肉中，烴類物質含量高于醛類和醇類物質[22]。云南牦牛干巴的風味組成中含量最高的是烴類，而醛類則是黃牛干巴的組成中含量最高的風味成分[2]。其中阿勒泰牛干巴與云南牦牛干巴中的烴類物質主要是長鏈脂肪烴與含苯芳香烴類，這類烴類物質主要來源于原料肉中動物飼料的沉淀，區(qū)別于貴州牛干巴中主要來源于香辛料的烯萜類物質。

對比國外的干腌牛肉制品，土耳其Pastirma 由于加工周期（1 個月左右）比較短，鑒定的揮發(fā)性化合物種類較少，總共有48 種揮發(fā)性成分被鑒定，而芳香烴類（甲苯）是成品中最豐富的成分。W?sierska 等[21]的研究發(fā)現(xiàn)：不同部位的牛肉制成的干腌牛肉的揮發(fā)性成分的組成是不同的，而脂肪氧化和微生物代謝是形成風味物質的主要途徑。通過對比國內外干腌牛肉制品可知：原料肉的性質差異、加工工藝的不同及配料使用的不同可能是導致各類產品風味組成差異的原因。

貴州牛干巴制作歷時約1 個月。較長的制作周期，給了脂肪足夠的時間氧化分解，形成了多種醛類，同時氨基酸的strecker 降解或微生物的代謝產生了醇類和其余風味物質，但通過感官評價發(fā)現(xiàn)，沒有感受到明顯油脂香氣。而花椒、五香調料等辛香料，也就是烴類物質風味較為明顯。出現(xiàn)這樣的情況是因為貴州地區(qū)天氣潮濕，肉制品易腐敗變質。傳統(tǒng)牛干巴中大量使用辛香料，可以達到抑菌、延長保質期的效果，同時這也導致牛干巴中辛香料風味過重，掩蓋了其余風味，造成整體風味不協(xié)調，缺乏牛肉香味的情況。

2.3 主成分分析

為了進一步直觀反映出不同牛干巴與其揮發(fā)性物質之間的關聯(lián)性，對相對含量大于0.5 的揮發(fā)性代謝物進行主成分分析，結果見圖1。

圖1 牛干巴風味成分主成分分析的得分散點圖和因子載荷圖Fig.1 Score and corresponding loadings plots rom principal component analysis of volatile aroma compounds

主成分1 的方差貢獻率為65.5%，主成分2 的貢獻率為34.4%，二者累計貢獻率已覆蓋風味品質信息。主成分 1 與（V48）1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇、（V47）芳樟醇、（V58）崖柏酮、（V55）芐醇、（V27）己醛等風味物質高度正相關，乙酸乙酯（V62）、2，3，5，6-四甲基吡嗪（V64）、二烯丙基二硫（V65）與主成分 2 高度正相關。說明1-甲基-4-（1-甲基乙烯基）環(huán)己醇、芳樟醇、崖柏酮、芐醇、己醛、乙酸乙酯等化合物是貴州牛干巴揮發(fā)性風味物質的主要特征化合物。由圖1a 可知，3 種牛干巴樣品根據(jù)其發(fā)性風味成分明顯分為3個區(qū)域，并且相距都比較遠，說明差異大，但1、3 號感官評分卻相近，這說明雖然差異大但也可得到類似的感官評分效果，不過其主體風味肯定不同。而且1、3 號風味成分都顯著多于2 號，但感官評分低于2 號，這說明不能僅靠添加更多的香辛料來提升牛干巴品質。改進牛干巴品質除了添加適當協(xié)調的香辛料外，還得通過改進其它工藝條件來完成。

圖1b 為香氣物質載荷圖，載荷系數(shù)反映了牛干巴中各揮發(fā)性化合物對各主成分的影響。牛干巴1 號在第一象限，正十三烷（V21）、癸醛（V34）、花椒素（V61）、乙酸乙酯（V62）對其影響顯著，為其特征性成分，牛干巴 2 號在第三象限，與烴類（己烷（V1）、辛烷（V2）等）和順-香葦醇（V54）、花椒素（V61）高度正相關，為其特征性成分，牛干巴3 號在第四象限，與反-β-羅勒烯（V17）、3-甲基十一烷（V10）、α-松油烯（V11）、芐醇（V55）、α-松油醇（V51）等化合物呈正相關。綜上所述，不同牛干巴與揮發(fā)性物質之間的相關性主要集中在來源于辛香料的烴類和醇類化合物。

2.4 不同牛干巴中細菌群落多樣性分析

2.4.1 測序數(shù)據(jù)質量分析

為了得到有效數(shù)據(jù)，對下機原始數(shù)據(jù)進行處理，相關質量分析及統(tǒng)計結果如表2所示。

表2 原始數(shù)據(jù)與有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 The original data and effective statistics

由表2可以看到，對低質量和無用序列進行過濾后，3 個樣品的Q20 和Q30 堿基百分比有所提高，分別達到97%和99%以上，有效降低了Illumina 平臺測序的錯誤率。

2.4.2 細菌群落的豐度分析

3 種貴州牛干巴的物種相對豐度分布（屬水平）如表3所示。

表3 貴州牛干巴優(yōu)勢細菌菌屬及其豐度Table 3 Abundance of predominant bacteria in samples Guizhou Niuganba

3 種牛干巴樣品中，在門水平上主要是軟壁菌門、擬桿菌門、藍藻菌門、變形菌門、互養(yǎng)菌門、綠屈撓菌門、放線菌門、熱袍菌門、厚壁菌門等。3 種牛干巴所含物種基本相似，主要優(yōu)勢菌是變形菌門和厚壁菌門。進一步對細菌群落中主要優(yōu)勢菌屬進行分析。不同種類牛干巴中細菌菌屬結構存在一定差異。在3 種牛干巴中，乳桿菌屬、葡萄球菌屬和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢菌，但比例差別較大；另外3 號牛干巴科貝特氏菌屬也為優(yōu)勢菌，這是貴州牛干巴特有的，其它地方牛干巴未見報道。不少學者對其他地區(qū)的牛干巴研究較多，肖蓉等[23]在牛干巴加工過程中，使用傳統(tǒng)分離篩選方法篩選到優(yōu)勢菌：埃希氏菌、微球菌、乳桿菌、假單胞菌和片球菌；呂彩霞[24]利用傳統(tǒng)分離篩選方法從云南牛干巴中篩選出4 株優(yōu)勢發(fā)酵菌，包括2 株肉糖葡萄球菌和2 株乳酸菌。劉姝韻等[25]利用變性梯度凝膠電泳技術對云南牛干巴加工過程中的細菌菌落多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌屬、嗜冷桿菌及明串珠菌屬為優(yōu)勢菌種；此外，牛干巴加工過程中還存在著不可培養(yǎng)的菌群。以上研究結果均與本研究有相似之處，也就是乳酸菌、葡萄球菌和嗜冷桿菌屬都為牛干巴優(yōu)勢菌屬。尤其是乳酸菌和葡萄球菌的代謝作用分解蛋白質為肽和氨基酸，不僅形成了大量風味物質，還對營養(yǎng)價值做出貢獻。其次是嗜冷桿菌屬，牛干巴1 號和牛干巴3 號樣品中相對豐度較高，分別為12.77%和28.44%，遠高于牛干巴1 號。嗜冷菌屬能夠分解脂類和水解蛋白質，從而引起輕微腥味和發(fā)霉的氣味[26]。但更有不同之處：首先3 號牛干巴含有特有的優(yōu)勢菌科貝特氏菌屬，這在其它地方牛干巴未見報道；再者環(huán)絲菌屬、明串珠菌屬、沙雷菌屬、弧菌屬、假單胞菌的相對豐度都低于5.6%，其中，嗜冷桿菌、弧菌屬、假單胞菌屬等在諸多肉制品腐敗變質過程中都被發(fā)現(xiàn)，它們被認為會對肉制品的安全和品質造成損害，所以貴州牛干巴安全性較好，這可能主要得益于香辛料對腐敗菌的抑制作用和氣候條件也有關系。

2.4.3 牛干巴聚類分析

牛干巴聚類分析結果見圖2。

圖2 牛干巴聚類分析Fig.2 Similarity coefficient based dendrogram constructed among samples

由圖2可知，牛干巴1 號（NGB1）和牛干巴2 號（NGB2）距離最近，其微生物種類和數(shù)量最為相似，這可能與它們的工藝較為相似有關。通過上述各水平的分析以及微生物群落結構的聚類分析已初步表明不同牛干巴的微生物群落結構有較大差異：雖然貴州牛干巴與云南牛干巴都以葡萄球菌屬和乳桿菌屬為優(yōu)勢菌，但是貴州牛干巴同時也以魏斯氏菌和嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢菌，具體的，其中牛干巴1 號優(yōu)勢菌為乳桿菌，2 號為葡萄球菌屬，3 號為嗜冷桿菌屬。而云南牛干巴還以明串珠菌屬菌為優(yōu)勢菌屬。

2.5 牛干巴揮發(fā)性風味物質與微生物的關系

3 種牛干巴樣品中的主要酸類物質都是乙酸。作為優(yōu)勢微生物的乳酸菌（乳桿菌、魏斯氏菌等）對發(fā)酵肉制品風味的貢獻，主要是通過分解代謝碳水化合物、氨基酸等產生有機酸。細菌對碳水化合物的代謝和脂質氧化可產生并不斷積累醇類物質，例如異型發(fā)酵的乳酸菌可產生乙醇，而苯乙醇等支鏈醇也可能是來源于微生物作用。有研究表明乳酸菌也會影響發(fā)酵香腸的脂肪氧化速率，脂肪氧化形成醛類、酮類物質，對干腌肉制品風味有重要貢獻。所有牛干巴樣品中均含有乙酸乙酯，酯類物質的形成主要與發(fā)酵相關。乳桿菌在牛干巴中占絕對優(yōu)勢地位，其代謝產物乙酸是形成乙酸乙酯及其他香味成分的重要物質基礎；明串珠菌可利用碳水化合物進行異型發(fā)酵產生乙酸，也可作為乙酸乙酯的前體物。

而且，3 種牛干巴雖然菌群豐富，但是由主成分分析知這3 種牛干巴的特征風味成分基本上都不是微生物代謝產生的而是來源于香料成分，微生物發(fā)酵對風味物質有所貢獻但不突出，這從牛干巴1 號和牛干巴2 號的微生物種類和數(shù)量最為相似但其感官評分和風味成分卻差別較大也能看出：微生物相似代謝物也應類似，但感官評分差別較大，這也說明微生物代謝產生的風味在其中不占主要作用，這可能是添加過多的香辛料抑制了微生物的代謝發(fā)酵作用。因此，為發(fā)揮微生物發(fā)酵代謝的優(yōu)異性能，后續(xù)需要加以改進發(fā)酵工藝。

3 結論

1）對貴州牛干巴進行了揮發(fā)性風味成分的種類與含量的分析。共檢測到67 種化合物，包括烴類（25）、醛類（14）、醇類（17）、酮類（5），其他類（6），其中共有成分有16 種。3 組牛干巴的揮發(fā)性風味成分在種類和含量上有差異，原因可能是原料肉、腌制方法、制作工藝等因素的不同。根據(jù)主成分分析可知：豐富多樣的辛香料為其風味做出了重要貢獻，但是過重的辛香料風味覆蓋了牛干巴該有的肉香。

2）運用高通量測序技術對采集的3 種傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴的細菌群落進行檢測。結果表明傳統(tǒng)發(fā)酵牛干巴中細菌多樣性豐富，主要優(yōu)勢菌是變形菌門和厚壁菌門，而乳桿菌屬和葡萄球菌屬占絕對優(yōu)勢。不同種類牛干巴中細菌菌屬結構存在一定差異，而且3 號牛干巴還存在科貝特氏菌屬優(yōu)勢菌，這是貴州牛干巴特有的。另外利用高通量測序發(fā)現(xiàn)存在部分不可培養(yǎng)菌種。

3）3 種牛干巴雖然菌群豐富，但是由多種分析知這3 種牛干巴的特征風味成分基本上都不是微生物代謝產生的而是來源于香料成分，微生物發(fā)酵對風味物質有所貢獻但不突出，添加過多的香辛料抑制了微生物的代謝發(fā)酵作用。后續(xù)需要加以改進發(fā)酵工藝發(fā)揮微生物發(fā)酵代謝的優(yōu)異性能。

4）對貴州牛干巴中揮發(fā)性風味成分的形成過程還需進一步研究：可探究其風味形成途徑、風味協(xié)調性與不可培養(yǎng)菌株的種類，為貴州牛干巴風味品質協(xié)調、生產工藝的調控、延長保質期等提供理論依據(jù)。開展貴州牛干巴貨架期的研究，增強牛干巴的商業(yè)性推廣。