李俊龍， 周 敏， 陳 林， 馮 鑫， 李江紅， 石克金， 戴青松， 沈旭東

(成都大學(xué) 四川抗菌素工業(yè)研究所 抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川 成都 610052)

0 引 言

結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種常見(jiàn)的慢性傳染病，可累及人體全身各個(gè)器官和組織，其中以肺結(jié)核最為常見(jiàn).據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，結(jié)核病是目前死亡率僅次于艾滋病的全球第二大致死疾病[1].1943年，瓦克斯曼從鏈霉菌中分離得到鏈霉素，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)對(duì)結(jié)核桿菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的活性，隨后鏈霉素被成功運(yùn)用于結(jié)核病的治療.迄今為止，其他一線抗結(jié)核藥物如異煙肼、利福平等，以及二線抗結(jié)核藥物氧氟沙星、卡拉霉素等也得以迅速發(fā)展.但由于抗結(jié)核藥物長(zhǎng)期的使用，臨床應(yīng)用中出現(xiàn)了治療周期長(zhǎng)、耐多藥結(jié)核廣泛耐藥且同時(shí)對(duì)潛伏狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌作用較弱等諸多問(wèn)題[2]，同時(shí)，結(jié)核病也呈現(xiàn)出卷土重來(lái)之勢(shì).因此，對(duì)抗結(jié)核藥物的開(kāi)發(fā)仍是當(dāng)前該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn).

研究人員發(fā)現(xiàn)，硝基咪唑類(lèi)藥物具有良好的抗結(jié)核桿菌活性，與傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物相比，硝基咪唑類(lèi)化合物具有全新的抗菌機(jī)制及結(jié)構(gòu)[3].其中，具有單環(huán)結(jié)構(gòu)的甲硝唑?yàn)?-硝基咪唑類(lèi)藥物，僅在厭氧環(huán)境中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌活性.1989年，印度Ciba-Geigy公司發(fā)現(xiàn)了具有廣譜抗結(jié)核桿菌活性的先導(dǎo)化合物CGI-17341，這類(lèi)雙環(huán)結(jié)構(gòu)的硝基咪唑類(lèi)化合物對(duì)多重耐藥結(jié)核分枝桿菌具有極強(qiáng)的活性，并對(duì)休眠的結(jié)核桿菌也有殺滅作用，但其具有較高的基因突變性[4].對(duì)此，研究人員在CGI-17341的基礎(chǔ)上合成了300多個(gè)3位取代的硝基咪唑吡喃類(lèi)化合物，其中，超過(guò)100個(gè)化合物具有潛在的抗菌活性.而PA-824就是從這100多個(gè)化合物中篩選得到的，盡管它的體外活性不是最高，但在動(dòng)物感染模型實(shí)驗(yàn)中，口服療效最好，同時(shí)具備最佳的藥動(dòng)學(xué)特性.該化合物屬于第一代硝基咪唑類(lèi)抗結(jié)核候選物，被認(rèn)為極有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景.其體外研究結(jié)果顯示，PA-824與傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用，無(wú)交叉耐藥現(xiàn)象，且與莫西沙星和吡嗪酰胺聯(lián)用療效最為顯著.但是，其溶解性較差抑制了PA-824的實(shí)際應(yīng)用，且在細(xì)菌誘變分析中，盡管與結(jié)構(gòu)更為簡(jiǎn)單的CGI-17341相比已經(jīng)有了顯著的降低，但PA-824致突變性仍然保持在相當(dāng)高的水平上[3].

研究發(fā)現(xiàn)，TBA-354化合物的設(shè)計(jì)的確提高了溶解度，也具有更好的抗菌活性及代謝穩(wěn)定性，且耐藥突變率大大降低，具有比PA-824更強(qiáng)的抗結(jié)核分枝桿菌活性與更高的安全性.但在臨床試驗(yàn)中，健康志愿者身上產(chǎn)生了神經(jīng)毒性，所以相關(guān)研究于2016年1月停止進(jìn)行[7-9].通過(guò)這些典型案例發(fā)現(xiàn)，為了解決此類(lèi)藥物溶解性差、易致突變等不足，研究者們已經(jīng)做了大量的研究.對(duì)此，本研究將對(duì)該類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)修飾的研究進(jìn)展進(jìn)行詳細(xì)闡述.

1 母環(huán)的修飾

1.1 硝基取代位置的改變

圖1 4-硝基咪唑及5-硝基咪唑結(jié)構(gòu)比較

1.2 硝基咪唑環(huán)5-位取代基的修飾

相比傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物，PA-824具有全新的作用機(jī)制.基于該化合物的重要性及獨(dú)特性，Bollo等[11]通過(guò)用溴、氯、氰基、氨基等基團(tuán)取代咪唑環(huán)上5-位碳原子合成一系列PA-824類(lèi)似物(見(jiàn)圖2)，以此來(lái)研究硝基咪唑環(huán)上的取代基對(duì)其抗菌活性的影響.

圖2 4-硝基咪唑環(huán)5-位取代基的修飾

由于PA-824在細(xì)胞內(nèi)的還原依賴(lài)于結(jié)核分枝桿菌中一個(gè)特殊的硝基還原酶Ddn，Bollo等[11]通過(guò)運(yùn)用電化學(xué)方法探索了化合物中硝基陰離子的穩(wěn)定性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，咪唑環(huán)的不同取代可以很大程度地影響其還原性和硝基陰離子的穩(wěn)定性.在對(duì)具體化合物進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，具有富電子基團(tuán)的硝基咪唑化合物在結(jié)核分枝桿菌中不可被還原，但當(dāng)引入缺電子化學(xué)基團(tuán)后，硝基咪唑環(huán)可發(fā)生緩慢還原，并且生成穩(wěn)定的硝基陰離子.同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)判斷化合物生成一氧化氮是否增多可定性分析其生物活性.此外，當(dāng)引入溴、氯等原子時(shí)，PA-824衍生物的還原依賴(lài)于另一種不同于Ddn的還原酶體系，但同時(shí)一氧化氮的生成也暗示著與PA-824相同的還原酶體系仍在發(fā)揮作用.盡管如此，這一系列PA-824衍生物對(duì)于野生型H-37-RV亞型的結(jié)核桿菌并沒(méi)有顯著效果，這可能是由于相關(guān)的硝基還原酶的空間位阻限制了硝基的還原而使這種電化學(xué)的還原無(wú)法在細(xì)胞內(nèi)高效地實(shí)現(xiàn).

1.3 母環(huán)骨架結(jié)構(gòu)的變換

1.3.2 3-硝基三唑類(lèi)化合物.

在研究抗腫瘤藥物2-硝基咪唑-偶聯(lián)氯喹啉NLCQ-1的衍生物NLCQ-2時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)了其在體外表現(xiàn)出對(duì)于休眠期的耐多藥結(jié)核桿菌具有良好的生物活性及選擇性的殺菌作用.2017年，Maria等[13]合成一系列3-硝基三唑磺胺類(lèi)藥物，其中很多化合物都具有選擇性的抗結(jié)核活性，而它們的2-硝基咪唑類(lèi)似物對(duì)于潛伏期的耐多藥結(jié)核桿菌也具有選擇性的抗結(jié)核活性.該研究通過(guò)篩選這些化合物在好氧或低氧條件下對(duì)耐多藥結(jié)核桿菌H-37Rv桿菌的活性，對(duì)耐多藥結(jié)核桿菌菌株、對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞或THP-1細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)活性以及對(duì)正常細(xì)胞的殺傷活性所獲得的體外數(shù)據(jù)表明，3-硝基-1，2，4-三唑基磺胺類(lèi)藥物在體外具有顯著抗結(jié)核活性.值得一提的是，這些化合物除了對(duì)好氧和低氧耐多藥結(jié)核桿菌具有活性外，還具有殺菌和細(xì)胞內(nèi)抗結(jié)核活性.研究表明，3-硝基三唑基類(lèi)似物(A)、(B)和(C)(見(jiàn)圖4)對(duì)好氧耐多藥結(jié)核桿菌具有選擇性作用，并顯示出殺菌和胞內(nèi)活性.而單一耐多藥結(jié)核桿菌菌株對(duì)所有具有較好活性的3-硝基三唑類(lèi)化合物均不具有交叉耐藥性，對(duì)好氧耐多藥結(jié)核桿菌具有活性的化合物則表現(xiàn)出中等至良好的選擇性指標(biāo).此外，3-硝基三唑基化合物也是非常有效的抗克魯茲錐蟲(chóng)的藥物.因此，該類(lèi)藥物的設(shè)計(jì)合成為抗耐多藥結(jié)核桿菌和克魯茲錐蟲(chóng)復(fù)合感染疾病提供了可能的候選藥物.

圖4 3-硝基三唑類(lèi)化合物

2 側(cè)鏈的修飾

2.1 側(cè)鏈的空間構(gòu)型修飾

在研究硝基咪唑類(lèi)抗結(jié)核藥物的過(guò)程中，對(duì)于其中具有手性中心的候選藥物，Li等[14]合成了具有兩個(gè)空間構(gòu)型不同的非對(duì)映異構(gòu)體trans和cis構(gòu)型，并測(cè)試了對(duì)應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu).其研究表明，兩種空間異構(gòu)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌都表現(xiàn)出類(lèi)似的活性，但兩者的水溶性均沒(méi)有得到改善.其構(gòu)象分析表明，對(duì)于化合物本身及其非對(duì)映異構(gòu)體，這些結(jié)構(gòu)差別較細(xì)微的化合物在溶液中都具有相似的空間構(gòu)象，因而也表現(xiàn)出類(lèi)似的活性.

2.2 側(cè)鏈雙芳基的結(jié)構(gòu)修飾

2.2.1 雙芳基的連接位點(diǎn)對(duì)其抗菌活性的影響.

研究證明，典型硝基咪唑類(lèi)藥物其連接的雙苯基側(cè)鏈(見(jiàn)圖5)與其生物活性存在相關(guān)性，在體外對(duì)復(fù)制和非復(fù)制的耐多藥結(jié)核桿菌都可顯著改善其生物學(xué)活性.其中，具有多種雙芳基鏈接方式的化合物，在結(jié)核感染小鼠模型中的抗結(jié)核活性顯著優(yōu)于母體藥物PA-824[15].總體而言，其MIC與側(cè)鏈取代基的親電性和吸電子性之間似乎存在一定的相關(guān)性.研究發(fā)現(xiàn)，化合物抵抗肝臟微生物降解的能力也可能是其體內(nèi)活性具有差異的原因之一.

圖5側(cè)鏈雙芳香基的不同連接位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)修飾

2.2.2 雙芳基之間連接子的插入.

研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)鏈上的雙芳基除了可以通過(guò)C-C鍵直接連接外，還可加入不同的基團(tuán)來(lái)完成雙芳基的連接(見(jiàn)圖6).大多數(shù)連接基團(tuán)在體外耐受性良好，但仍然具有一些不利影響的連接子.例如，磺胺或脂肪族NH的連接基團(tuán)，這些化合物通常在低氧條件下表現(xiàn)出很差的活性.研究證實(shí)，連接子的親脂性和電子特性都不是影響活性的顯著因素.在pH值為7的體系中，連接子為酰胺或磺酰胺基團(tuán)時(shí)可提高溶解度4～6倍，而加入哌嗪或哌啶基團(tuán)時(shí)則僅在低pH值時(shí)可提高水溶性至1～2個(gè)數(shù)量級(jí)[16].

圖6側(cè)鏈雙芳基之間不同連接子的插入

另外，親脂性和具有極性的官能基團(tuán)，例如羧基、烷基胺、哌嗪、哌啶、磺胺等，在體外均可保持良好的生物學(xué)活性，特別是當(dāng)這些連接子與含吡啶環(huán)等親水基團(tuán)結(jié)合后還可以有助于改善其水溶性.研究人員將具有這類(lèi)連接模式的化合物進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)都顯示出高的穩(wěn)定性，在急性期感染小鼠模型中，含吡啶的衍生物在體內(nèi)活性顯著優(yōu)于母體化合物PA-824，且在慢性感染模型體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)于藥物delamanid近24倍的生物活性，并具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征及口服生物利用度.其中，基于這類(lèi)修飾策略的最優(yōu)化合物結(jié)構(gòu)在急性感染小鼠模型中表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性，其活性比PA-824高3個(gè)數(shù)量級(jí)，是吡啶連接時(shí)的4倍，是可溶性氨基甲酸酯連接的26倍.此類(lèi)新化合物其具有良好的口服生物利用度(61%)和良好的安全性.但是，其溶解性差且與血漿蛋白結(jié)合率高仍然限制了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用[17].此外，當(dāng)引入苯乙炔，吡啶乙炔等不飽和連接子時(shí)，其生物活性均低于PA-824.

2.2.3 以氮雜環(huán)取代苯環(huán)的結(jié)構(gòu)修飾策略.

以抗結(jié)核藥物PA-824為基礎(chǔ)，科研人員研究了以氮雜環(huán)取代苯環(huán)(見(jiàn)圖7)，來(lái)探索聯(lián)苯—?；?lèi)2-硝基咪唑的氮雜和二氮雜類(lèi)似物，以期發(fā)展一種生物活性更優(yōu)、毒副作用更低的抗結(jié)核候選藥物.通過(guò)合成實(shí)驗(yàn)制備了一種新型的強(qiáng)效雙芳基類(lèi)化合物，旨在通過(guò)引入吡啶類(lèi)官能團(tuán)以提高水溶性，同時(shí)保持高代謝穩(wěn)定性和有效性.其具體設(shè)計(jì)思路是用吡啶、吡嗪或嘧啶等取代一個(gè)或兩個(gè)苯基以減少親脂性.研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)末端吡啶或近端雜環(huán)的引入，在保留了藥效的基礎(chǔ)上，同時(shí)改善了溶解度.特別是在低pH值的情況下，后者顯示了更好的體內(nèi)活性、高代謝穩(wěn)定性以及出色的藥代動(dòng)力學(xué).而在小鼠急性結(jié)核分枝桿菌感染的模型中，科研人員發(fā)現(xiàn)了多種類(lèi)似的化合物比母體藥物要好100倍，兩種口服生物可利用的吡啶類(lèi)似物(相比母體化合物，在低pH值環(huán)境下，藥物溶解度改善了3～4倍)在慢性感染模型中其生物活性?xún)?yōu)于抗結(jié)核藥物OPC-67683.

圖7側(cè)鏈芳基的雜環(huán)化修飾

研究發(fā)現(xiàn)，就聯(lián)吡啶和吡啶二氮雜環(huán)類(lèi)似物而言，雖然改進(jìn)了其溶解度(在pH值為7時(shí)達(dá)到0.7 mg/mL)，但其生物活性較弱.其中，末端苯環(huán)被吡啶取代的幾種化合物在體外對(duì)復(fù)制性和非復(fù)制性結(jié)核分枝桿菌都保持高活性.此外，聯(lián)苯基和吡啶類(lèi)相結(jié)合的類(lèi)似物也可以顯著改善其溶解度，且在體內(nèi)和體外都能維持其穩(wěn)定的抗菌活性.對(duì)于后者而言，在末端連接苯環(huán)不僅能提高藥物的脂溶性，同時(shí)也能提高體外抗菌活性及在急性感染期模型中的體內(nèi)活性[18].

2.3 母環(huán)與芳香基之間連接子的修飾

2.3.1 母環(huán)與芳基間以醚鍵為連接子.

Thompson等[19]通過(guò)合成不同連接取代的化合物并檢測(cè)其生物活性發(fā)現(xiàn)，具有α-甲基或者去除芐基的亞甲基修飾的硝基咪唑衍生物在體外具有良好的活性.而基于雙苯基對(duì)于急性期感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠在其體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)于PA-824近8倍的抗菌活性和高代謝穩(wěn)定性.其研究表明，利用丙烯基、丙基、戊氧基等延長(zhǎng)連接子修飾的化合物對(duì)處于復(fù)制期的結(jié)核桿菌敏感，而丙基醚連接的無(wú)論是單分子還是雙芳基類(lèi)似物在厭氧環(huán)境下均表現(xiàn)出卓越的抗菌活性.相比芐基苯基和二芳基的衍生物，以O(shè)CH2連接子連接時(shí)具有最高的抗菌活性.相關(guān)研究數(shù)據(jù)也顯示，具有丙氧基連接的化合物不僅在急性期模型中抗菌療效高于母體藥物PA-824近89倍，而且在慢性期模型中，抗菌效果也優(yōu)于OPC-67683.另外，研究還發(fā)現(xiàn)，三氟甲醚吡啶可以提高抗菌活性及水溶性，是具有潛力的候選物.以丙烯基、炔氧基等連接時(shí)，衍生物可表現(xiàn)出在有氧環(huán)境中對(duì)處于復(fù)制期的結(jié)核桿菌高效的抑制作用.而在單芳基化合物中，丙氧基的連接子改良了其在厭氧環(huán)境下的抗菌效果，但其他方式修飾的化合物中仍以甲醚基連接表現(xiàn)出最好的抗菌活性.

2.3.2 咪唑環(huán)與芳基間以酰胺類(lèi)為連接子.

Blaser等[20]研究表明，通過(guò)酰胺、氨基甲酸酯和尿素等取代甲基醚連接子可以改善藥物水溶性，提高代謝穩(wěn)定性和安全性，而引入這些連接子能提高2～4倍的抗復(fù)制期結(jié)核桿菌作用.雙芳基化合物在急性結(jié)核分枝桿菌感染的小鼠體內(nèi)具有高于母體藥物5倍的抑菌作用，但其水溶性差.用芳基哌嗪取代雙芳基不僅保證了其高效的抗菌作用，同時(shí)提高藥物水溶性，甚至在慢性感染模型中的治療效果可以與OPC-67683相媲美.此外，延長(zhǎng)酰胺后，氨基甲酸酯單芳基化合物在有氧環(huán)境下的抗菌作用和安全性得以提高.雙芳基側(cè)鏈系列本身具有高效的抗菌活性，引入酰胺、尿素等連接子后提高了其溶解性，并保證了良好的藥物動(dòng)力學(xué).

2.3.3 咪唑環(huán)與芳基間以碳氮鍵為連接子.

Cherian等[21]基于4-(三氟甲氧乙氧基)芐胺基的亞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合理衍生化，得到了一系列具有以碳氮鍵為連接子的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物(見(jiàn)圖8).研究發(fā)現(xiàn)，

圖8母環(huán)與芳香基之間連接子的修飾

其具有較高的好氧細(xì)胞活性和無(wú)氧的全細(xì)胞活性.與其母體化合物相比，候選藥物的活性均有近10倍的提升.同時(shí)，對(duì)復(fù)制和非復(fù)制的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行了全細(xì)胞活性測(cè)試，通過(guò)測(cè)試確定了Ddn的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，降低了其前藥的活性.該研究有效拓展了具有碳氮鍵連接子的各類(lèi)衍生物，根據(jù)定量構(gòu)效關(guān)系研究，合理解釋了這類(lèi)化合物表現(xiàn)出的高抗菌活性，并通過(guò)進(jìn)一步藥效學(xué)研究確定了該類(lèi)修飾的化合物在體內(nèi)具有良好的代謝穩(wěn)定性和溶解性.

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，硝基咪唑類(lèi)抗結(jié)核藥的研究取得了一定成果，出現(xiàn)了許多新型及不同作用機(jī)制的抗結(jié)核候選藥物，但是由于其致突變性、神經(jīng)毒性、溶解性等原因阻礙了這類(lèi)藥物的進(jìn)一步發(fā)展.因此，綜合上述結(jié)構(gòu)改造策略以開(kāi)發(fā)新型的硝基咪唑類(lèi)抗結(jié)核先導(dǎo)化合物仍有待開(kāi)展.具體而言，研究思路可以從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：首先，在現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，開(kāi)展更多的結(jié)構(gòu)修飾和衍生，制備大量的化合物，建立更為廣泛的化合物庫(kù)，篩選活性好，毒性低，且更具成藥性的先異物；其次，借助有機(jī)全合成的方法，構(gòu)建具有潛在抗菌活性的新型骨架結(jié)構(gòu)，以期得到具有新作用機(jī)制的先異物；最后，利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)以及人工智能，結(jié)合組合化學(xué)及高通量篩選等方法，構(gòu)建有效的篩選模型，大大縮短藥物的開(kāi)發(fā)時(shí)間，進(jìn)而提高藥物的開(kāi)發(fā)效率.