吳子健，石振鵬，侯惠靜，姜帆

（1.天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.天津天獅學院生物與食品工程學院，天津301700）

蛋白質分子中的ε-氨基與多糖還原性末端上的羰基之間可在一定條件下自發(fā)形成蛋白質糖基化產物，能夠顯著提高蛋白質的功能性（如：水溶性、乳化性、熱穩(wěn)定性等），反應通常加熱處理，而無需添加其他的化學試劑，屬于“綠色加工工藝”[1]。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）在生物化學及其他相關方面的研究中常作為一種標準蛋白來使用[2]，同時也是一種天然的營養(yǎng)素載體，而通過糖基化改性，可進一步提高其乳化活性，改善其對營養(yǎng)素的包埋效果，BSA糖基化后，可在乳化過程中快速移動到油水界面，并在界面展開重排，對于包埋油溶性的營養(yǎng)素具有很好的效果[3-4]。

常用糖基化改性方法主要有兩種，即干熱法及濕熱法。Cheetangdee N等[5]采用干熱法制備β-乳球蛋白-己糖接枝物，提高其在等電點處的乳化活性；李海明[6]采用濕熱法制備玉米醇溶蛋白-葡萄糖（或木糖）接枝產物，顯著提高了玉米醇溶蛋白的親水性。本研究以乳化活性為指標，優(yōu)化濕法美拉德反應制備牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產物的工藝，并對葉黃素進行包埋，檢測其對油溶性分子的包埋效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白Ⅴ（分子量68 kDa）：Solarbio公司；葡聚糖（分子量20 kDa）：MACKLIN公司；溶菌酶標品（14.3 kDa）、卵清蛋白標品（44.3 kDa）、卵轉鐵蛋白標品（77.9 kDa）、甲狀腺球蛋白標品（165 kDa）：sigma aldrich公司；其余試劑均為國產分析純；去離子水、超純水為天津市食品生物技術重點實驗室自制。

1.2 儀器與設備

T 10 basic ULTRA-TURRAX小型分散機：德國IKA公司；SIM-F140BDL制冰機：日本Panasonic公司；3-18K離心機：德國Sigma公司；Seven Excellence pH計、UV-5紫外可見分光光度計：瑞士METTLER公司；2000 ES全自動四元梯度高效液相色譜儀：美國科學公司；FD-5N真空冷凍干燥機：日本EYELA公司；PROTEIN KW-803分子凝膠色譜柱（300 mm，8.0 mm×5 μm）：日本SHIMADZU公司；SE 260垂直電泳系統(tǒng)：美國Hoefer公司；Essential V6凝膠成像系統(tǒng)：英國U－vitec公司；AH100B高壓均質機：加拿大ATS公司；Ariummini plus純水機：德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 BSA-dextran接枝物的制備

參考Jiang Z等[7]的方法并做調整：將葡聚糖（dextran）與BSA按一定摩爾比混合，溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中，恒溫反應一定時間后，樣品冰浴下冷卻，4℃下離心（4 500 g，15min）取上清，上清液再在4.0℃下透析24 h（分子截留量為20 kDa±0.2 kDa），最后凍干，產物即為牛血清白蛋白-葡聚糖接枝物（BSA-dextran，DBSA）。

1.3.2 單因素試驗

以反應溫度、反應時間、反應物配比、BSA濃度、緩沖液體系pH值為單因素，以反應后DBSA接枝物的乳化活性為響應值，優(yōu)化生成DBSA接枝物的反應條件。

1.3.3 響應面分析試驗

單因素試驗基礎上，根據Box-Benhnken的原理[8]，以 BSA濃度（A）、底物配比（B）、緩沖液體系 pH值（C）、時間（D）、溫度（E）為自變量，以產物乳化活性（Y）為響應值，設計五因素三水平共46個試驗點，其中6個為中心零點試驗，40個為析因試驗。零點為區(qū)域的中心值，析因點為自變量取值在A、B、C、D、E所構成的三維頂點。將因素的上下水平編碼為1、-1，具體因素編碼見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1 Variables and levels in central composite design

1.3.4 乳化活性的測定

乳化活性的測定參考吳鵬等[9]的方法并做調整，取1.0 mL糖蛋白溶液（2.0 mg/mL）與200.0 μL大豆油混合，16 000 r/min條件下勻漿1.0 min后，立即從底部吸取100.0 μL勻漿液，置于5 mL SDS溶液（0.1%）中，然后迅速振蕩混勻，并在500 nm處測定吸光度（以0.1%SDS溶液為空白）。乳化活性（emulsifying ability index，EAI）按公式（1）計算。

式中：A500為乳狀液吸光度值；n為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質質量濃度，mg/mL；φ為油相體積分數(shù)（φ=0.2）。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

參考Bu G等[10]的方法：分離膠濃度10%，濃縮膠濃度4%，蛋白上樣濃度1.0 mg/mL，上樣量7.0 μL，電泳電壓200 V，電泳結束后考馬斯亮藍R-250染色，再經脫色后拍照。

1.3.6 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法

采用Bhatia M等[11]的方法并做調整：分子凝膠色譜柱（PROTEIN KW-803，300 mm，8.0 mm×5 μm）蛋白樣品濃度2.0 mg/mL，進樣體積20 μL，流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm；流動相0.3 mol/L NaCl（0.05 mol/L PBS 緩沖液，pH 6.80），時間 0～18 min。標準分子量蛋白采用溶菌酶、卵清蛋白、牛血清白蛋白Ⅴ、卵轉鐵蛋白、甲狀腺球蛋白，以保留時間為橫坐標，蛋白分子量的ln值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.7 葉黃素包埋顆粒的制備

乙醇注入-高壓均質法[12]制備葉黃素包埋顆粒：將BSA和DBSA分別溶于去離子水中，蛋白濃度為2mg/mL，充分溶解后再葉黃素乙醇溶液逐滴加入BSA或DBSA溶液中，使得每100 mL蛋白溶液中含葉黃素2 mg，充分混勻1.0 h，旋轉蒸發(fā)（加熱溫度55.0℃）除去乙醇后，冰浴冷卻后并用0.1 mol/L HCl調pH值至4.70，然后高壓均質（85 000 kPa條件下，循環(huán)3次），于4.0℃下靜置12 h，即得載有葉黃素的包埋顆粒，最后將上述葉黃素蛋白均質液進行真空冷凍干燥，即得固體的牛血清白蛋白-葉黃素包埋顆粒（bovine serum albumin-lutein，BSA-lutein）和牛血清白蛋白-葡聚糖-葉黃素包埋顆粒（bovine serum albumin-dextran-lutein，DBSA-lutein）。

葉黃素的包封率按照如下的公式（2）進行計算：

游離葉黃素含量通過有機溶劑洗滌法[13]測定：取0.5 mL的BSA-lutein或DBSA-lutein，加入2.0 mL正己烷，充分混合，7 000 r/min下離心5 min，并收集上層有機相。重復2次該操作，合并有機相，測定其在448 nm處的吸光值。以不同濃度葉黃素（正己烷溶解）在448 nm處吸光值做標準曲線（y=0.822x+0.016，R2=0.99），計算出游離葉黃素的含量。

總葉黃素含量通過十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）增溶法[14]測定：取 0.5 mL 的 BSA-lutein或DBSA-lutein，加入SDS（終濃度為0.3 mol/L）溶液充分振蕩混合，30.0℃孵育5 min，測定其在448 nm處的吸光值，以不同濃度葉黃素（SDS溶解）在448 nm處吸光值做標準曲線（y=28.89x-0.013，R2=0.99）計算出包埋顆粒中葉黃素的總含量。

1.3.8 試驗數(shù)據統(tǒng)計與分析

所有試驗均重復3次，結果以均值±標準差的形式表示，并運用Origin 8.0與SPSS 17.0進行繪圖及數(shù)據分析；響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6進行試驗設計與數(shù)據統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 濕法接枝反應條件對DBSA乳化活性的影響

2.1.1 反應溫度對DBSA乳化活性的影響

控制緩沖液體系pH值為7.50，BSA濃度2.0mg/mL，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）3.5∶1，反應時間為3.0 h，調節(jié)反應體系的溫度為 80.0、85.0、90.0、95.0、100.0℃，研究所得產物DBSA的乳化活性變化，結果如圖1所示。

圖1 溫度對DBSA乳化活性的影響Fig.1 Effects of temperature on emulsifying activity of DBSA

隨著反應體系溫度的升高，DBSA的乳化活性逐漸升高，當體系溫度達到90.0℃時，其乳化活性最好，為24.67 m2/g；當溫度高于90.0℃時，乳化活性顯著降低（P＜0.05）。這可能是因為高溫反應時，部分BSA迅速聚集沉淀，導致溶解度降低，從而使得乳化活性下降。

2.1.2 反應時間對DBSA乳化活性的影響

控制反應體系溫度90.0℃，緩沖液體系pH值為7.50，BSA 濃度 2.0 mg/mL，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）3.5∶1，調節(jié)反應時間為 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，研究所得產物DBSA的乳化活性變化，結果如圖2所示。

隨著反應時間的增加，DBSA的乳化活性逐漸升高，當反應時間為2.0h時，其乳化活性最好，為25.59 m2/g，與未反應BSA的乳化活性（16.98 m2/g）相比，提高了0.5倍；但是隨著反應時間的進一步增加，DBSA的乳化活性顯著降低（P＜0.05）。這可能是由于蛋白質引入的糖鏈過多，致使蛋白質過度親水，失去親水親油平衡，導致乳化活性的下降[14]。

圖2 時間對DBSA乳化活性的影響Fig.2 Effects of time on emulsifying activity of DBSA

2.1.3 底物配比對DBSA乳化活性的影響

控制反應體系溫度為90.0℃，反應時間2.0 h，緩沖液體系pH值為7.50，BSA濃度2.0 mg/mL，調節(jié)底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）為 1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1，研究所得產物DBSA的乳化活性變化，結果如圖3所示。

圖3 底物配比對DBSA乳化活性的影響Fig.3 Effect of the raito of dextran to BSA on emulsifying activity of DBSA

隨著底物配比中dextran含量的增加，DBSA的乳化活性先降低后升高：這可能是因為當?shù)孜锱浔葹?∶3時，反應體系中BSA含量較高，即使反應程度較低，測得乳化活性值仍較高；當?shù)孜锱浔葹?∶1的時候，DBSA乳化活性最好，為26.9 m2/g，顯著高于底物配比為1∶3 時 DBSA 的乳化活性（25.12 m2/g）（P＜0.05），說明通過接枝反應可以使得相同摩爾質量的BSA的乳化活性得到進一步的提高；但是當dextran含量進一步增加后，乳化活性反而降低。這可能是因為溶液中dextran含量過高，使得溶液黏度過大，流動性變差，不利于美拉德反應的發(fā)生[15]。

2.1.4 BSA濃度對DBSA乳化活性的影響

控制反應體系溫度為90.0℃，反應時間為2.0 h，緩沖液體系pH值為7.50，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）5∶1，調節(jié) BSA 濃度為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL，研究所得產物DBSA的乳化活性變化，結果如圖4所示。

圖4 BSA濃度對DBSA乳化活性的影響Fig.4 Effect of the concentration of protein on emulsifying activity of DBSA

隨著BSA濃度的增加，DBSA的乳化活性先升高后降低：當BSA濃度為2.0 mg/mL時，DBSA乳化活性最好（P＜0.05），為 26.83 m2/g；BSA 濃度繼續(xù)增大，其乳化活性反而降低，這與Viviane D的研究結果一致[16]。

2.1.5 緩沖液體系pH值對DBSA乳化活性的影響

控制反應體系溫度為90.0℃，反應時間2.0 h，底物配比（dextran∶BSA，摩爾比）為 5∶1，BSA 濃度 2.0 mg/mL，調節(jié)緩沖液體系 pH 值為 6.50、7.00、7.50、8.00、8.50，研究所得產物DBSA的乳化活性變化，結果如圖5所示。

圖5 pH對DBSA乳化活性的影響Fig.5 Effects of pH on emulsifying activity of DBSA

隨著緩沖液體系pH值的增加，DBSA的乳化活性逐漸增大，當pH值為8.00時，DBSA乳化活性最好（P＜0.05），為 27.32 m2/g；pH 值繼續(xù)增大，DBSA 乳化活性開始下降，這與Ho Y T等[17]的研究結果一致。

2.1.6 Box-Behnken試驗方案及結果

根據表1所設計的試驗方案，通過Design-Expert 8.0軟件計算出實際水平[18]。試驗方案及結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Design results of Box-Behnken

2.1.7 模型建立及顯著性分析

使用Design-Expert 8.0軟件，以Y（乳化活性）對表2中獲得的數(shù)據進行多元回歸擬合分析，得到的二次回歸模型方程如下：Y=25.79+3.34 A+2.11 B+4.22 C-0.7D+0.95E-0.47AB+0.94AC-0.37AD-0.86AE+1.07BC+0.45BD+1.96BE+0.67CD+0.69CE+0.95DE-1.85A2-2.60B2-2.60C2-1.78D2-0.81E2。該模型的方差分析結果如表3所示。

表3 響應面二次回歸方程模型方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

回歸方程模型的F檢驗顯著，失擬項不顯著，這表明其他因素對試驗結果的干擾較小，該模型能較好地反映數(shù)據。證明用此模型進行對DBSA乳化活性的優(yōu)化是可行的。其中BSA濃度（A），底物配比（B），pH值（C）對乳化活性的影響為極顯著，溫度（E）對乳化活性的影響為顯著，時間（D）對乳化活性的影響不顯著；交叉項只有BE對乳化活性的影響為顯著；平方項A2，B2，C2，D2對乳化活性的影響為極顯著。交叉作用顯著的因素的曲面圖和等高線圖如圖6所示。

圖6 底物配比和溫度相互作用對乳化活性的影響Fig.6 Effect of substrate ratio and temperature interaction on emulsifying activity

2.1.8 最佳接枝產物工藝參數(shù)

根據模型求響應面的極值點，理論最佳條件為BSA 濃度 2.78 mg/mL，dextran∶BSA（摩爾比）=6.89∶1，pH值8.50，反應時間2.3 h，反應溫度95.0℃，乳化活性最高為32.138 m2/g。以該最佳條件進行試驗驗證，試驗重復3次，乳化活性為（31.743±0.45）m2/g，與預測值接近。這表明該具有一定的實用價值。

2.2 接枝產物結構分析

2.2.1 SDS-PAGE分析

DBSA電泳圖譜結果如圖7所示。

隨著濕法美拉德反應的進行，BSA的特征條帶逐漸變淺，而在分離膠頂端出現(xiàn)兩條明顯的蛋白條帶，這表明有大分子量的糖蛋白形成，出現(xiàn)兩條分子量不同的蛋白，可能是由于BSA的接枝度不同導致的，且隨著反應時間的進一步增加，分子量低的糖蛋白逐漸減少，分子量高的糖蛋白逐漸增多。

2.2.2 HPLC分析

為了進一步研究所形成的糖蛋白的分子量，采用高效液相色譜（HPLC）進行分析，以保留時間為橫坐標，標準蛋白分子量的ln值為縱坐標，得到標準曲線如圖8所示。

圖7 牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產物的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of BSA-Dextran Graft Product

圖8 高效液相色譜洗脫時間標準曲線Fig.8 Standard curve of clution time of HPLC

回歸方程為y=-0.592x＋15.39，R2=0.987，蛋白質分子量范圍在14 kDa～165 kDa內線性關系良好。BSA及DBSA的液相圖譜如圖9所示。

圖9 牛血清白蛋白及接枝產物HPLC圖Fig.9 HPLC of BSA and DBSA

由文獻[19]可知，蛋白質的分子量越大，保留時間越短，BSA的保留時間為7.182 min，DBSA的保留時間為5.853 min，表明了大分子量的糖蛋白生成，根據標準曲線計算得到新的糖蛋白的分子量約為152 kDa。

2.3 葉黃素包埋顆粒的包封率

圖10為經過乙醇注入-高壓均質法制備的蛋白-葉黃素包埋顆粒的凍干粉末。

圖10 蛋白-葉黃素包埋顆粒的照片F(xiàn)ig.10 Picture of BSA-lutein and DBSA-lutein embedded particles

BSA-lutein粉末顏色為淡黃色，DBSA-lutein相較于BSA-lutein黃色更深，二者復溶后，僅從感官上觀察不出區(qū)別，但與lutein相比，二者在水中的溶解度有著明顯的提高，且溶液在放置一周后，BSA-lutein溶液底部會觀察到沉淀，說明葉黃素包埋顆粒聚集形成了大粒子而沉淀，但DBSA-lutein溶液則仍能保持均勻，這證明了蛋白質在與葡聚糖發(fā)生接枝反應后能夠減少了顆粒的聚集，提高葉黃素的穩(wěn)定性[20]。根據1.3.7中的方法計算得：接枝后，DBSA-lutein的包封率達到95.86%，高于BSA-lutein的77.82%，這與試驗預期的情況相符。

3 結論

本文以乳化活性為指標，通過單因素結合響應面試驗優(yōu)化濕法美拉德反應制備牛血清白蛋白-葡聚糖接枝產物的工藝，得到的二次回歸模型方程經檢驗證明是合理可靠的。其中各因素對乳化活性影響的大小關系為pH值＞BSA濃度＞底物配比＞溫度＞時間，最佳工藝參數(shù)為BSA濃度2.78 mg/mL、dextran∶BSA（摩爾比）=6.89∶1、pH 8.50、反應時間 2.3 h、反應溫度 95.0 ℃，此時制得的接枝產物乳化活性為（31.743±0.45）m2/g，分子量約為152 kDa，純度為89.449%。使用DBSA制備的葉黃素包埋顆粒的包封率達到95.86%。