馬銀鵬 包怡紅 張丕奇 韓增華 馬慶芳 張先成*

（1東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

黑木耳（Auricularia heimuer）[1]質(zhì)地滑嫩、清脆可口，是一種重要的食藥用菌[2]。近年來黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，對黑木耳菌種的需求越來越大，但黑木耳菌種市場“同物異名、同名異物”現(xiàn)象普遍存在（主要由于相互頻繁引種并自主命名造成），這給黑木耳品種的知識產(chǎn)權保護帶來了很大困難[3]。

為了保護黑木耳種質(zhì)資源知識產(chǎn)權，有必要了解生產(chǎn)上應用黑木耳菌株規(guī)范性，并對黑木耳菌株進行區(qū)別性鑒定[4]。隨著分子生物技術的發(fā)展，分子標記被應用到菌株區(qū)別性鑒定中。ISSR（Intersimple Sequence Repeat）是一種簡單重復序列間擴增多態(tài)性分子標記[5]，具有豐富的擴增多態(tài)性，并具有快速、簡便、可靠等特點，廣泛應用到種質(zhì)資源鑒定、遺傳作圖、系統(tǒng)發(fā)育、分子標記育種等方面[6]。劉華晶等[7]利用PCR-ISSR體系，選出9個ISSR引物，通過聚類分析成功分析了黑龍江省33個野生木耳菌株和8個栽培菌株的遺傳多樣性。任廣明等[8]采用ISSR分子標記技術構建了黑龍江省伊春地區(qū)23個黑木耳主栽品種DNA指紋圖譜。

筆者采用ISSR分子標記方法對來自黑龍江東寧縣不同單位黑木耳菌株進行區(qū)別性鑒定，以評價黑木耳菌種市場的規(guī)范化程度。

1 材料與方法

1.1 供試菌株來源

選取2017年春季黑龍江省東寧縣兩個黑木耳主栽品種，分別以黑木耳1號和黑木耳2號取代市場真實商品名，采集東寧縣不同地域（單位）的黑木耳菌株共30株，利用cPDA培養(yǎng)基分離純化30株黑木耳菌株，經(jīng)5次純化后，28株黑木耳菌株無性狀分離，形態(tài)特性均一穩(wěn)定。根據(jù)菌絲形態(tài)特征和對峙試驗并結(jié)合地區(qū)代表性，篩選出10個黑木耳菌株進行ISSR研究（表1）。上述菌株均保藏于黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 菌絲體培養(yǎng)及總DNA提取

將純化后的菌株接入250 mL三角瓶PD培養(yǎng)基中，25℃條件下120 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d，9391×g離心收集菌絲體，-20℃保存?zhèn)溆谩２捎酶倪M的CTAB法提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總DNA質(zhì)量，紫外分光光度法檢測樣品總DNA濃度，稀釋到相應濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ISSR-PCR擴增

根據(jù)加拿大哥倫比亞大學（UBC）設計的ISSR引物，選擇10個多態(tài)性高、重復性好的引物（表2）進行PCR擴增，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

反應體系：10 μL 2×Tap Mix（納川），1 μL引物（0.5 μmol/L），1 μL 總 DNA（50 ng/μL），ddH2O補至20 μL。反應程序：94℃預變性 5 min；94℃變性30 s，相應退火溫度退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。每條引物重復擴增3次，篩選出多態(tài)性高、重復性好的擴增圖譜進行數(shù)據(jù)分析。

表1 供試黑木耳菌株

表2 ISSR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

比對和校正ISSR擴增圖譜，對于同一條引物的擴增圖譜，遷移率相同的條帶記為一個位點，擴增陽性賦值為“1”，擴增陰性賦值為“0”，構建初始0/1數(shù)據(jù)矩陣。采用NTsys_2.02軟件計算遺傳相似系數(shù)，基于UPGMA方法構建聚類圖譜并進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA（圖1），紫外分光光度法檢測發(fā)現(xiàn)A260與A280比值為1.86，因此，提取到的總DNA可用于ISSR分析。

圖1 基因組DNA檢測圖譜

ISSR-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從10條引物中篩選出7條引物（引物1、引物2、引物3、引物4、引物7、引物8和引物9）擴增條帶具有多態(tài)性。擴增條帶大小為300～4000 bp。7條擴增具有多態(tài)性的引物共擴增出25種條帶，其中7種條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比例為28%。

圖2 引物7瓊脂糖凝膠電泳圖譜

表3 10株黑木耳菌株遺傳相似系數(shù)

利用NTsys_2.02軟件對10株黑木耳菌株進行UPGMA聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10株黑木耳菌株遺傳相似系數(shù)為0.72～1（表3）。用NTsys_2.02軟件基于UPGMA方法構建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3）。10株黑木耳菌株的遺傳相似性較高，在相似系數(shù)為0.88處將供試樣本分為兩大類群。黑木耳1號中的1、2-2、5、11、12、23和黑木耳2號中的15、20共計8個黑木耳菌株聚為一類，遺傳相似系數(shù)為1，此8株黑木耳菌株為同一個黑木耳品種。黑木耳1號中的8-1和22兩個黑木耳菌株聚為一類，遺傳相似系數(shù)為0.88，這兩個菌株與其他8株黑木耳菌株可能為不同的黑木耳品種。

圖3UPGMA聚類分析圖譜

3 小結(jié)與討論

采用對峙培養(yǎng)法進行黑木耳區(qū)別性鑒定，操作方便、成本低，且鑒定結(jié)果易于觀察[9]。拮抗試驗發(fā)現(xiàn)10株黑木耳菌株中8-1、22與其他菌株形成溝壑型拮抗線，但是拮抗線不明顯。因此，通過拮抗試驗較難判斷8-1與22為不同黑木耳品種，需要結(jié)合細胞學、生化和DNA水平對黑木耳菌株進行區(qū)別性鑒定。

ISSR分子標記從DNA水平檢測基因組DNA多態(tài)性，受環(huán)境條件影響很小，可有效鑒定不同黑木耳栽培品種[10]。利用ISSR分子標記研究發(fā)現(xiàn)黑木耳2號中的15、20菌株與其他6個黑木耳1號菌株聚為一類，這8株菌株為同一黑木耳品種，因此黑木耳菌種市場存在同物異名現(xiàn)象。黑木耳1號中的8-1和22兩個菌株聚為一類，與其他8株黑木耳菌株可能為不同的黑木耳品種，因此黑木耳菌種市場存在同名異物現(xiàn)象。這表明黑木耳菌種引種、命名相對混亂，給黑木耳品種的知識產(chǎn)權保護、菌種質(zhì)量管理和品種審定帶來了很大的困難。品種是豐產(chǎn)的根本，種源不清晰、品種不純正等可能會造成減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，嚴重影響黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展，因此亟須規(guī)范菌種市場。

王晗等[12]通過酯酶同工酶鑒定不同地區(qū)引種的黑木耳菌株，結(jié)果將10個菌株分為3個組群。筆者研究結(jié)果與其基本一致，因此，ISSR分子標記可以作為一種有效的黑木耳菌株區(qū)別性鑒定的方法。其他分子標記如SSR[13-14]和SRAP[15-16]等也已被應用到品種區(qū)別性鑒定中，后續(xù)需采用多種分子標記相結(jié)合的方法共同鑒定不同地區(qū)引種的黑木耳菌株。