楊紅寧，呂蘭欣，顏曉慶，韓 東，胡書群，許 鐵

一氧化氮(nitric oxide, NO)是一種脂溶性、可擴(kuò)散的、小分子氣體信號(hào)分子，同時(shí)也是一種弱自由基，在調(diào)節(jié)生理和病理生理活動(dòng)中起重要作用[1-3]。早期研究表明NO對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物活動(dòng)的調(diào)節(jié)主要通過NO/cGMP途徑，即NO誘導(dǎo)cGMP的產(chǎn)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白激酶G的活性，影響生物體的活動(dòng)[4-5]。近來文獻(xiàn)表明NO通過蛋白質(zhì)巰基亞硝基化/去亞硝基化的機(jī)制來發(fā)揮作用，蛋白質(zhì)巰基亞硝基化/去亞硝基化作為一種可逆性蛋白質(zhì)翻譯后修飾、調(diào)節(jié)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而影響許多細(xì)胞的功能[1,6]。

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制假說包括鈣超載、谷氨酸興奮毒性及氧自由基學(xué)說。谷氨酸受體分為代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors, mGluRs)和離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors, iGluRs)。iGluRs根據(jù)其所首選的配體不同可分為NMDA受體、AMPA受體和KA受體[7-8]。腦缺血再灌注損傷中，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的nNOS活性增強(qiáng)，產(chǎn)生大量的NO，能夠?qū)ι窠?jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用[9-11]。

Trx(thioredoxin)在正常生理狀態(tài)下其本身是亞硝基化的，全腦缺血再灌注后Trx巰基發(fā)生去亞硝基化[12-14]。本研究主要采用大鼠全腦缺血再灌注不同的時(shí)間來探討全腦缺血再灌注誘導(dǎo)Trx巰基去亞硝基化的最佳復(fù)灌時(shí)間，以及外源性NO供體GSNO(S-nitrosoglutathione)和SNP(sodium nitroprusside)在全腦缺血再灌注后Trx的去亞硝基化機(jī)制中的作用，并用焦油紫染色進(jìn)一步驗(yàn)證外源性NO供體GSNO和SNP是否能對(duì)全腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與器材試劑：GSNO購自Sigma公司，SNP購自徐州市中心醫(yī)院，Trx抗體購自Santa Cruz公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。器材：電動(dòng)勻漿器購自美國(guó)Glas-Col公司，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購自美國(guó)Molecular Device公司，蛋白電泳及電轉(zhuǎn)移裝置購自美國(guó)Bio-Rad公司，圖像處理儀購自美國(guó)Gene公司，大鼠腦立體定位儀購自美國(guó)STOLTING公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的雄性成年無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、全腦缺血再灌注組(I/R組)、腹腔注射組(SNP組)、側(cè)腦室注射(GSNO組)及溶劑對(duì)照組(生理鹽水組腹腔注射/側(cè)腦室注射)，每組各6只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型及樣品制備采用四動(dòng)脈結(jié)扎法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，以20%水合氯醛(300～350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，電凝椎動(dòng)脈。手術(shù)第2天動(dòng)物于清醒狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，全腦缺血15 min。假手術(shù)組只進(jìn)行顱部手術(shù)的皮膚切口，然后縫合。GSNO組(每千克體質(zhì)量動(dòng)物0.1 mg，藥物溶于生理鹽水，于缺血前20 min側(cè)腦室注射)，SNP組(SNP溶解于生理鹽水中，以5 mg·kg-1的劑量分別于缺血前30 min、缺血后40 min和130 min腹腔注射給藥，即每?jī)纱谓o藥之間相隔90 min)。溶劑對(duì)照組注射等量溶劑生理鹽水。全腦缺血復(fù)灌注后，斷頭取腦，分離雙側(cè)海馬CA1區(qū)，加勻漿緩沖液后勻漿離心取上清液，用BCA微量法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 蛋白巰基亞硝基化測(cè)定用生物素轉(zhuǎn)化法(Biotin-Swich method)[11]測(cè)定蛋白亞硝基化：用HEN液(250 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH 7.7，1 mmol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1neocuproine)勻漿，1 000 g 4 ℃離心10 min，取上清；測(cè)蛋白，計(jì)算蛋白濃度，轉(zhuǎn)變?yōu)榻y(tǒng)一濃度0.8 mg·mL-1，每次取0.8 mg分裝蛋白，用HEN液補(bǔ)充至1 mL；向分裝的蛋白中加10% CHAPS至終濃度為0.4%，再加4倍體積Blocking buffer，置于50 ℃ 20 min，不斷搖勻；加2倍體積丙酮放入-20 ℃，20 min到30 min后2 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清；加HENS液(250 mmol·L-1HEPES，pH 7.7，1 mmol·L-1EDTA，0.1 mmol·L-1neocuproine，1% SDS) 0.1 mL·mg-1重懸，轉(zhuǎn)入EP管中，加Biotin-HPTP(4 mmol·L-1)，即labeling solution，體積為重懸液的1/3，再加Ascorbate solution，體積為重懸液的1/5，25℃水浴1 h；加2倍體積的冰丙酮放入-20 ℃ 20 min，2 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清；加HENS液，0.1 mL·mg-1，重懸，加2倍體積的中和液(20 mM HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，0.5% TritonX-100)，再加15 μl·mg-1Steptavidin-Agarose，冷庫旋轉(zhuǎn)混勻1 h；每管加0.5～0.6 mL(600 mM NaCl)中和液洗5次，800 g×1 min，4 ℃離心；用洗脫液(20 mmol·L-1HEPES-NaOH，pH 7.7，100 mmol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA和100 mmol·L-12-巰基乙醇)加4×sample buffer，混勻煮沸5 min，冷卻待用。

1.3.3 免疫印跡等量蛋白樣品經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至NC膜上。轉(zhuǎn)移后的NC膜經(jīng)3% BSA封閉后加入不同的稀釋好的一抗，4 ℃過夜。洗膜后加入相應(yīng)的二抗(羊抗兔IgG-AP 或羊抗鼠IgG-AP或驢抗羊IgG-AP)，37 ℃反應(yīng)2 h。洗膜。曝光法顯色，結(jié)果以圖像處理儀(Gene Company)分析處理，并以LabWorks軟件分析處理，各條帶的吸光值(O.D值)以同一張膜上假手術(shù)組的倍數(shù)表示。

1.3.4 焦油紫染色大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，4%的多聚甲醛快速灌注后，大鼠斷頭取腦。4%多聚甲醛固定，常規(guī)包埋與切片。按焦油紫染色說明書染色，中性樹脂封片。在高倍鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元，有清楚的細(xì)胞核，胞體著色良好的計(jì)為成活神經(jīng)元，成活神經(jīng)元密度以1 mm長(zhǎng)度內(nèi)成活錐體神經(jīng)元的數(shù)量表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)灌6 h Trx巰基去亞硝基化程度最高全腦缺血后復(fù)灌注不同時(shí)間組相比，Trx巰基亞硝基化水平在復(fù)灌6 h時(shí)最低(P<0.05)，見圖1。證明大鼠全腦缺血再灌注誘導(dǎo)Trx去亞硝基化的最佳復(fù)灌時(shí)間為6 h。

①與其他組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖1 Trx去亞硝基化水平電泳圖

2.2 GSNO、SNP抑制Trx巰基去亞硝基化與I/R組相比GSNO組和SNP組Trx的亞硝基化水平明顯增高(P<0.05)，見圖2A、B。證明外源性NO供體能夠抑制全腦缺血再灌注導(dǎo)致的Trx去亞硝基化。

2.3 GSNO和SNP組海馬神經(jīng)元遲發(fā)性死亡情況用焦油紫染色來檢測(cè)腦缺血再灌注刺激后錐體細(xì)胞的存活情況。在Sham組，正常的錐體細(xì)胞顯示出圓形淡著色的細(xì)胞核(圖3 a, f)，而在I/R組，死細(xì)胞呈現(xiàn)出固縮的細(xì)胞核，呈皺縮濃密的不規(guī)則狀(圖3 b, g)。與I/R組相比，GSNO組(圖3 c, h)，SNP組(圖3 d, i)神經(jīng)元錐體細(xì)胞的死亡明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而溶劑對(duì)照組(圖3 e, j)則與I/R組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。說明GSNO，SNP能夠減少CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用。

①與I/R組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A:GSNO組；B:SNP組圖2 Trx去亞硝基化水平電泳圖

3 討論

蛋白質(zhì)巰基亞硝基化和去亞硝基化，是蛋白質(zhì)功能動(dòng)態(tài)調(diào)控中的一種重要翻譯后修飾，在調(diào)節(jié)生理和病理情況下的蛋白酶活性中起著重要的作用，能夠調(diào)節(jié)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)而影響許多細(xì)胞的功能[6]。蛋白質(zhì)半胱氨酸巰基被NO修飾發(fā)生亞硝基化，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一種常見的機(jī)制[15-17]。蛋白質(zhì)的亞硝基化/去亞硝基化可以影響到蛋白的活性、穩(wěn)定性。酶原的降解、酶的活性位點(diǎn)的暴露、功能蛋白活性位點(diǎn)的修飾都可以與亞硝基化修飾有關(guān)[18-20]。Trx是一種重要的具有蛋白還原酶活性的抗氧化蛋白，五半胱氨酸殘基在32、35、62、69、73位，是一種抗凋亡蛋白，因?yàn)樗軌蛞种频蛲鲶w前蛋白[8]。Trx的氧化還原調(diào)控和抗凋亡功能依賴69位半胱氨酸的S-亞硝基化。Trx在正常的生理狀態(tài)下是亞硝基化的，Trx能夠清除活性氧和維持其自身的氧化還原調(diào)控功能，有助于抗凋亡，而全腦缺血再灌注誘導(dǎo)Trx發(fā)生去亞硝基化對(duì)神經(jīng)元造成了損傷[21]。本研究采用大鼠四動(dòng)脈結(jié)扎法造模，從本研究中可以看出，全腦缺血再灌注后Trx發(fā)生巰基去亞硝基化，并且在復(fù)灌6 h時(shí)Trx的去亞硝基化程度最高。

圖3 各組缺血再灌注后錐體細(xì)胞存活情況

①與I/R組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖4 各組缺血再灌注后細(xì)胞存活情況比較

越來越多的數(shù)據(jù)表明，NO能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)巰基的亞硝基化修飾，即在電子受體的存在下可以與蛋白質(zhì)巰基發(fā)生反應(yīng)，形成巰基—亞硝基化蛋白(SNO蛋白)。因此，本研究中給予了NO供體GSNO和SNP，來研究外源性NO供體是否能夠抑制全腦缺血誘導(dǎo)的Trx去亞硝基化，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，全腦缺血再灌注后Trx發(fā)生明顯的去亞硝基化，而外源性NO供體GSNO和SNP能夠減弱這種變化，通過焦油紫染色進(jìn)一步證實(shí)外源性NO供體能夠抑制Trx去亞硝基化，對(duì)腦缺血損傷的神經(jīng)元具有保護(hù)作用。

本研究初步揭示了Trx去亞硝基化影響神經(jīng)元損傷的機(jī)制，為后續(xù)研究Trx去亞硝基化對(duì)神經(jīng)元損傷的下游神經(jīng)通路提供了基礎(chǔ)，也為研究卒中疾病的作用機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。