高謀 徐如祥 王文佳 董勤 丁柏勻 姚慧 楊志軍

目前，顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）仍是嚴重影響發(fā)達國家和發(fā)展中國家患者生活質量的主要神經系統(tǒng)疾病[1,2]。研究發(fā)現(xiàn)TBI后炎癥反應可加重神經細胞損傷，是造成TBI后神經功能障礙的重要原因之一[3-5]。值得注意的是TBI后補體系統(tǒng)激活在中樞神經系統(tǒng)（central nervous system,CNS）炎癥反應中發(fā)揮了關鍵作用，并且補體活化水平與腦損傷程度密切相關[6-8]。例如，補體活化產物可參與TBI后繼發(fā)性腦損傷，加重神經細胞損傷，延緩神經功能恢復[9,10]。近來，隨著對干細胞移植治療CNS疾病研究的深入，干細胞不僅可在神經修復與再生方面發(fā)揮作用，而且干細胞生物學行為與補體系統(tǒng)也有著重要聯(lián)系[11-14]。筆者曾報道經靜脈移植誘導型神經干細胞 （induced neural stem cells，iNSCs）可抑制TBI后補體活化，減少了補體活化產物C3d和C5b-9沉積于神經細胞上，從而減輕了補體活化引起的繼發(fā)性腦損傷[15,16]。此外，筆者發(fā)現(xiàn)用TBI小鼠血清處理iNSCs，可上調其補體調節(jié)因子Crry的表達量[15,16]。為進一步研究TBI小鼠血清處理iNSCs對其移植調控TBI后補體活化的作用，本研究分別用TBI小鼠血清、熱滅活TBI小鼠血清或磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered solution，PBS）預處理 iNSCs， 并將 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs經立體定向移植到TBI小鼠腦內，觀察腦組織中補體活化產物（C3d和 C9）、補體調節(jié)因子Crry和細胞凋亡標記物active Caspase-3等蛋白表達水平，以及腦組織內NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞的分布情況，以探討TBI動物血清預處理iNSCs立體定向移植對TBI后補體活化的影響，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

健康成年雄性C57BL/6小鼠54只，8～10周齡，體質量24～30 g，所有實驗動物（無特定病原體級）均購自北京維通利華公司。

二、主要實驗儀器和試劑

儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國），超凈工作臺 （ESCO公司，美國），倒置相差顯微鏡、CM1950冰凍切片機、TCS SP5Ⅱ激光共聚焦顯微鏡和DM3000熒光顯微鏡（Leica公司，德國），微量電動組織勻漿器（IKA公司，德國），電泳儀、電泳槽、轉膜儀和Gel Doc XR System凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國）。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基、B27、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、Accutase酶、左旋谷酰胺和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（Invitrogen 公司，美國），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma公司，美國），BCA試劑盒 （Thermo公司，美國），C3d 抗體 （工作濃度：5 μg/mL）（R&D Systems公司，美國），C9 抗體（工作濃度：1 μg/mL）和 active Caspase-3 抗體（工作濃度：1 μg/mL）（Abcam 公司，美國），Crry 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（BD Biosciences公司， 美國），GAPDH 抗體 （工作濃度：0.2 μg/mL）（Santa Cruz公司，美國），HRP標記兔抗山羊IgG抗體（工作濃度：0.08 μg/mL）、HRP 標記山羊抗兔 IgG抗體（工作濃度：0.08 μg/mL）和HRP標記山羊抗大鼠 IgG 抗體 （工作濃度：0.08 μg/mL）（ZSGB-BIO 公司，中國），NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/mL）（Millipore公司，美國），Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN 抗體（工作濃度：2 μg/mL）（Life Tech 公司，美國 ），4’,6-二 脒 基 -2-苯 基 吲 哚 （4’,6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI）（Southern Biotech 公司， 美國），原位末端標記（TUNEL）試劑盒（Roche公司，德國）。

三、C57BL/6小鼠iNSCs體外培養(yǎng)

C57BL/6小鼠 iNSCs用含 2%B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF、0.05%BSA 和 2 mmol/L 左旋谷酰胺的DMEM/F12與Neurobasal等體積混合培養(yǎng)基培養(yǎng)。

四、C57BL/6小鼠TBI模型制備

用異氟烷氣體麻醉劑麻醉小鼠，并將其固定于腦立體定向儀上，備皮消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚，暴露前囟，以lambda縫向喙側2.0 mm、中線偏右側2.0 mm為撞擊點。用自由落體腦打擊裝置，撞針直徑3.0 mm，制備 TBI模型。 設置假手術（sham）組（6只），僅切開頭皮，不實施撞擊。于傷后1 h對TBI小鼠進行神經功能缺損評分（neurological severity scores，NSS），將 NSS 為 4～8 分者（48 只）納入 TBI組。

五、預處理iNSCs和細胞移植

按照隨機數(shù)字表法選取24只TBI小鼠用于制備TBI小鼠血清和熱滅活TBI小鼠血清。用Accutase酶消化法制備iNSCs單細胞懸液，用PBS漂洗后離心棄去上清，用500 μL的TBI小鼠血清、熱滅活TBI小鼠血清或PBS重懸細胞，接種于24孔板（細胞密度為 1×106個/孔），置于 37℃培養(yǎng)箱中處理45 min。收集細胞懸液，用PBS漂洗3遍，用臺盼藍染色法計數(shù)活細胞，用PBS重懸細胞并調整細胞密度。余下24只TBI小鼠于傷后12 h，用腦立體定向儀按照隨機數(shù)字表法將5 μL含1×106個TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs單細胞懸液分別移植到小鼠腦內：TBI-iNSCs移植組 （6只）、HITBI-iNSCs移植組（6 只）和 PBS-iNSCs移植組（6 只），另設對照（Control）組（6 只）。

六、Western blot

于TBI后14 d，麻醉動物后處死，收集各組新鮮腦組織。用電子分析天平量取腦組織，用微量電動組織勻漿器勻漿，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，行Western blot檢測各組腦組織中 C3d、C9、Crry 和active Caspase-3蛋白的表達水平。用SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制膠，取30～40 μg蛋白樣品，電泳分離后轉至PVDF膜，用含有5%BSA的TBS封閉1～2 h 后，分別加入 C3d 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、C9抗體（工作濃度：1 μg/mL）、Crry 抗體（工作濃度：5 μg/mL）、active Caspase-3 抗體（工作濃度：1 μg/mL）和 GAPDH 抗體（工作濃度：0.2 μg/mL）在 4℃孵育過夜。用PBS漂洗后，分別加入HRP標記兔抗山羊IgG 抗體（工作濃度：0.08 μg/mL）、HRP 標記山羊抗兔IgG抗體（工作濃度：0.08 μg/mL）和HRP標記山羊抗大鼠 IgG 抗體（工作濃度：0.08 μg/mL），室溫反應2～3 h。用PBS漂洗后，在暗室內用ECL顯色劑顯色并使用Gel Doc XR System凝膠成像分析系統(tǒng)曝光。 計算 C3d/GAPDH、C9/GAPDH、Crry/GAPDH和active Caspase-3/GAPDH蛋白的相對表達量。

七、腦組織冰凍切片、免疫熒光染色和TUNEL染色

于TBI后14 d，取各組相同部位小鼠腦組織經固定后，行冰凍切片，切片厚度為10 μm。行免疫熒光染色，用10%BSA/0.3%TritonX-100封閉1 h后，加入 NeuN 抗體（工作濃度：5 μg/mL）在 4℃孵育過夜。用PBS漂洗后，加入Alexa Fluor?633標記山羊抗小鼠NeuN抗體（工作濃度：2 μg/mL）室溫避光孵育2 h。用PBS漂洗后，行TUNEL染色，并用DAPI染細胞核，封片后，在熒光顯微鏡下觀察，在20×鏡下隨機選取6個視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)（特異性抗體標記）和總細胞數(shù)（DAPI標記），計算陽性細胞百分率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

八、統(tǒng)計學分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。小鼠腦組織中 C3d/GAPDH、C9/GAPDH、Crry/GAPDH 和active Caspase-3/GAPDH蛋白的相對表達量，以及NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞的數(shù)量以均數(shù)±標準差（±s）表示，資料先進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、TBI小鼠血清預處理iNSCs移植物影響C3d、C9、Crry和 active Caspase-3蛋白的表達水平

在TBI后14 d，取各組動物腦組織行Western blot檢測，經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)：相比Sham組，PBS-iNSCs組、HITBI-iNSCs組、TBI-iNSCs組和 Control組C3d、C9和active Caspase-3表達水平明顯增高，組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而與Control組相比，PBS-iNSCs組、HITBI-iNSCs組和 TBI-iNSCs組C3d、C9和active Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；與 PBS-iNSCs組和 HITBI-iNSCs組相比，TBI-iNSCs組C3d、C9和active Caspase-3表達水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 1）。

此外，相比Sham 組，PBS-iNSCs組、HITBI-iNSCs組和TBI-iNSCs組 Crry表達水平明顯增高 （P＜0.05）； 相比 Control組，PBS-iNSCs組、HITBI-iNSCs組、TBI-iNSCs組和Sham組Crry表達水平明顯增高，組間差異具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；與PBS-iNSCs組和HITBI-iNSCs組相比，TBI-iNSCs組Crry表達水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表 1）。

二、TBI小鼠血清預處理iNSCs移植物減少NeuN抗體陽性和TUNEL陽性的細胞

在TBI后14 d，3組TBI小鼠腦組織中均可見NeuN抗體陽性和TUNEL陽性的細胞（圖1）。3組NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞所占比分別為：PBS-iNSCs組（14.84%±1.60%）、HITBI-iNSCs組（13.52%±1.36%）及 TBI-iNSCs組（7.61%±0.76%）。經統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，PBS-iNSCs組和HITBI-iNSCs組的NeuN抗體陽性和TUNEL陽性的細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。然而，與 PBS-iNSCs組和HITBI-iNSCs組比較，TBI-iNSCs組NeuN抗體陽性和TUNEL陽性的細胞數(shù)量明顯減少，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=53.535，P＜0.05）。

表1 顱腦創(chuàng)傷14 d后的各組小鼠腦內C3d、C9、Crry和active Caspase-3蛋白的表達水平（±s）

與 Sham 組比較，aP＜0.05；與 Control組比較，bP＜0.05；與 TBI-iNSCs組比較，cP＜0.05；

A c t i v e C a s p a s e-3/G A P D H蛋白相對表達量S h a m 組 6 0.0 2±0.0 1 0.4 2±0.0 4 0.7 2±0.0 7 0.3 2±0.0 3 C o n t r o l組 6 1.4 5±0.1 2 a 1.5 1±0.1 4 a 0.3 6±0.0 2 a 1.5 7±0.1 4 a T B I-i N S C s組 6 0.6 2±0.0 7 ab 0.6 0±0.0 5 ab 1.5 0±0.1 3 ab 0.5 9±0.0 5 ab H I T B I-i N S C s組 6 0.9 4±0.1 0 abc 1.0 5±0.1 0 abc 0.9 5±0.0 8 abc 0.9 2±0.0 8 abc P B S-i N S C s組 6 1.0 0±0.0 9 abc 1.0 0±0.0 9 abc 1.0 0±0.0 8 abc 1.0 0±0.0 9 abc F值 2 3 4.6 3 5 1 3 3.0 5 6 1 4 8.9 3 8 1 8 8.6 0 8 P值 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0 0.0 0 0組別 只數(shù) C 3 d/G A P D H蛋白相對表達量C 9/G A P D H蛋白相對表達量C r r y/G A P D H蛋白相對表達量

討 論

近來研究認為補體系統(tǒng)是大腦發(fā)育的重要參與者，例如補體 C3、C3a、C3aR、C5a和 C5aR 對神經發(fā)生具有積極的調節(jié)作用[14,17]。然而，補體系統(tǒng)過度活化可加劇TBI后CNS炎癥反應和繼發(fā)性腦損傷[14,18]。此外，越來越多的證據(jù)表明補體系統(tǒng)過度活化可產生大量補體因子，不利于神經環(huán)路穩(wěn)定性的維持，并與多種神經精神疾病密切相關[19,20]。由此可見，有效調控TBI后補體活化不僅可減輕補體介導的腦損傷，而且有利于TBI后神經功能重塑，促進患者神經功能恢復[21]。本課題組曾報道經靜脈移植iNSCs可抑制TBI后補體活化，減少了補體活化產物C3d和C5b-9沉積于神經細胞上，從而減輕了補體活化引起的腦組織損傷[16]。為深入研究iNSCs移植調控TBI后補體活化的作用，筆者在前期實驗發(fā)現(xiàn)TBI小鼠血清處理iNSCs，可上調其Crry表達量的基礎上，進一步探討經TBI小鼠血清預處理iNSCs立體定向移植對TBI后補體活化的影響[16]。結果顯示TBI動物腦組織中補體活化產物C3d和C9較Sham組明顯增高，并且細胞凋亡標記物active Caspase-3的表達水平也明顯高于Sham組，這些數(shù)據(jù)再次證明了TBI后補體活化引起了繼發(fā)性腦損傷。值得注意的是，接受 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或 PBS-iNSCs移植物的小鼠腦組織中C3d、C9和active Caspase-3的表達量均明顯低于Control組，說明iNSCs立體定向移植可發(fā)揮抑制TBI后補體活化，減輕腦組織損傷等作用。此外，接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠腦內C3d、C9和active Caspase-3的表達量無明顯差異，而接受TBI-iNSCs移植物小鼠腦內C3d、C9和active Caspase-3的表達量明顯低于HITBI-iNSCs組和PBS-iNSCs組，說明TBI小鼠血清預處理iNSCs可明顯增強其抑制TBI后補體活化參與的腦損傷的作用。

圖1 3組小鼠顱腦創(chuàng)傷14 d后的腦組織免疫熒光染色和TUNEL染色檢測（×400）

為探討iNSCs立體定向移植調控TBI后補體活化的作用機制，本研究檢測了各組動物腦內補體調節(jié)因子Crry的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)TBI可明顯減少腦內Crry的表達量，然而接受 TBI-iNSCs、HITBI-iNSCs或PBS-iNSCs移植物的小鼠腦組織中Crry的表達量明顯高于Control組，說明iNSCs立體定向移植可增加TBI動物腦內Crry表達量從而發(fā)揮抑制TBI后補體活化的作用。除此之外，接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠腦內Crry的表達量無明顯差異，而接受TBI-iNSCs移植物小鼠腦內Crry的表達水平明顯高于HITBI-iNSCs組和PBS-iNSCs組，說明TBI小鼠血清預處理iNSCs立體定向移植可明顯上調TBI動物腦內Crry的表達量。隨后，本研究檢測了各組動物腦組織中NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞的分布情況，結果發(fā)現(xiàn)接受HITBI-iNSCs和PBS-iNSCs移植物小鼠腦內NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞的數(shù)量無明顯差異，然而接受TBI-iNSCs移植物小鼠腦內NeuN抗體陽性和TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯低于HITBI-iNSCs組和PBS-iNSCs組，說明TBI小鼠血清預處理iNSCs立體定向移植可明顯抑制TBI后補體活化引起的腦組織損傷。

綜上所述，TBI小鼠血清預處理iNSCs立體定向移植可上調TBI小鼠腦內Crry水平，抑制補體活化，減輕腦損傷。通過對比前期研究中所采用的經靜脈移植iNSCs，筆者認識到立體定向移植可更加精準地將iNSCs靶向輸送到達腦損傷區(qū)，并同樣發(fā)揮調控TBI后補體活化和減輕繼發(fā)性腦損傷等作用。需要注意的是TBI后全身多個器官內均可檢測到補體活化產物介導的病理損傷，而經靜脈移植iNSCs可減少TBI后全身多個器官內補體活化產物的表達量，進而減輕組織病理損傷[15]。因此，后續(xù)研究筆者將重點關注：經TBI小鼠血清預處理iNSCs立體定向移植在調控TBI動物腦內補體活化的基礎上對全身多個器官補體活化水平的影響。