魏小翠，穆 睿，畢 博，韓璧瑤，于泓川，陳 博，王 玥，史小蕾，臧圣奇，金 磊

作者單位：210002南京，南方醫(yī)科大學南京臨床醫(yī)學院（東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院）口腔科[魏小翠（醫(yī)學碩士研究生）、穆 睿、畢 博、韓璧瑤、于泓川、陳 博、王 玥、史小蕾、臧圣奇、金 磊]

0 引 言

應用于頜面部大面積骨缺損修復的組織工程支架除需具有良好的生物相容性外，還需要優(yōu)異的機械性能來承擔應力并支撐組織再生。本課題組前期成功制備出機械強度高，孔隙率大小合適的三維聯(lián)通納米氧化鋯（Zirconia，ZrO2）支架用于骨組織工程，經(jīng)體內(nèi)外實驗證實其具有良好的成骨能力［1-3］。但ZrO2是惰性陶瓷材料，與細胞及組織親和性欠佳。氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）作為石墨烯的氧化衍生物，因其優(yōu)異的理化性能以及良好的生物活性在組織工程領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注［4-8］。其表面豐富的含氧基團可提供活躍的結(jié)合位點，易于與特定的生物分子，蛋白及藥物相互作用，從而進一步功能化［9-10］。因此，采用GO修飾ZrO2支架有望進一步改善其機械性能及生物活性。

在骨缺損修復研究中，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）是主要的種子細胞來源，并且代表了骨修復的金標準。然而BMMSCs取材時骨髓抽取過程痛苦，大樣本培養(yǎng)時獲得的有核細胞數(shù)量有限，并且容易隨著代數(shù)遞增其增殖和分化能力降低，以上缺點限制了BMMSCs的應用［11-12］。人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是來源于牙齒的間充質(zhì)干細胞，可以從脫落的乳牙或因治療需要拔除的離體牙中取材，不會為患者增加額外痛苦。并且已有研究證實hDPSCs具有成骨分化能力，一定誘導條件下可以形成具有Havers系統(tǒng)和血管組織的成熟骨組織樣結(jié)構(gòu)［13-14］。這些優(yōu)勢使hDPSCs成為合適的骨組織工程種子細胞來源。本研究將GO均勻結(jié)合于三維ZrO2支架表面，檢測復合支架壓縮強度的變化，并與hDPSCs共培養(yǎng)，進一步研究復合支架的體外細胞相容性，從而綜合評估其在頜面部骨缺損修復中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與細胞 天然石墨粉（美國Bay Carbon）；硅烷耦聯(lián)劑（GLYMO）（美國Sigma Aldrich）；TRITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液（1：500）（德國Millipore）；細胞活力檢測試劑（MTS）（美國Promega）。hDPSCs為本實驗室從離體牙中分離提取、保存的細胞株。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理會批準（批準號：2017NZGKJ-048），患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器 掃描電子顯微鏡（SEM）及X光微區(qū)分析（EDS）（日本Tanaka）；透射電子顯微鏡（TEM，日本JEM-200CX）；傅里葉紅外光譜儀（FTIR，美國NICOLET）。

1.3 方法

1.3.1 GO的合成 采用改良Hummers法合成GO。用電子天平精確稱量1 g天然石墨粉，加入25 mL濃硫酸，冰浴中混合。緩慢加入3.5 g高錳酸鉀，冰浴中攪拌＞2 h。加熱至35℃后繼續(xù)攪拌反應1 h，加入80 mL去離子水，緩慢攪拌并加熱至98℃反應15 min，采用100 mL去離子水進一步稀釋反應液，并滴入雙氧水至無氣泡冒出?；旌弦河孟←}酸及去離子水充分離心洗滌，真空冷凍干燥12 h。

1.3.2 GO的表征 將少量GO粉末分散于無水乙醇中，滴于銅柱上，60℃下干燥，表面噴金后置于電鏡托盤上，SEM下觀察GO表面形貌；將少量GO粉末分散于無水乙醇中，負載于銅網(wǎng)上，進行TEM測試；將GO粉末采用KBr壓片法制樣，進行FTIR測試，掃描范圍為（500～4000）/cm。

1.3.3 GO修飾三維ZrO2支架的制備 制備三維ZrO2支架進行以下復合實驗［1］。40℃下將ZrO2支架浸入3%GLYMO/乙醇溶液中靜置30 min，輕吹，120℃下烘烤。分別稱取5、1、1.5 mg的GO粉末分散于10 mL去離子水中，超聲震蕩3 h，制得均勻分散的0.5、1、1.5 mg/mL的GO分散液。將硅烷化后的ZrO2支架分別浸入3種濃度的GO分散液中反應1 h，得到3組復合支架，分別為0.5、1、1.5 mg/mL GOZrO2，40℃下烘干備用。掃描電鏡下觀察單純的ZrO2支架與上述3個濃度GO修飾的ZrO2支架，后期選擇ZrO2支架與最適宜濃度GO結(jié)合的復合支架（GO-ZrO2）進行下一步實驗。

1.3.4 復合支架的機械性能檢測 制備0.5 cm×1.0 cm×1.5 cm的GO-ZrO2及ZrO22種支架用于壓縮強度測試，將萬能試驗機的機頭加載速度設為0.5 mm/min，記錄壓縮強度。

1.3.5 復合支架細胞相容性測試 將GO-ZrO2及ZrO22種支架與hDPSCs共培養(yǎng)，采用靜態(tài)表面接種法接種細胞。在接種之前，將支架浸入完全培養(yǎng)基中，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。移去培養(yǎng)基，取生長狀態(tài)良好的第3代hDPSCs，調(diào)整細胞密度為每100 μL細胞懸液中含有1×106個細胞，逐滴加入到2種支架中，于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵化4 h，繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。細胞培養(yǎng)1、3、5 d時，將復合細胞的支架用37℃預熱的PBS溶液輕柔地漂洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.5%Triton X-100溶液透化處理5 min，加入TRITC標記的鬼筆環(huán)肽工作液（1∶500）至沒過支架表面，室溫避光孵育染色1 h。加入1 μg/mL的DAPI染色液避光孵育5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞在支架上的黏附形態(tài)。

按上述方法接種細胞，細胞培養(yǎng)1、3、5 d后，MTS法檢測細胞增殖情況。具體方法為：將支架取出置于干凈的培養(yǎng)孔，每孔分別加入100 μL培養(yǎng)基，20 μL的MTS溶液，避免產(chǎn)生氣泡，放入37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中靜置孵化1 h，吸取反應后懸液各100 μL置于96孔板中，490 nm波長下測A值。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，定量資料以均值±標準差（xˉ±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 GO的制備和表征 真空冷凍干燥后的GO樣品呈淺棕色片狀，經(jīng)超聲震蕩后可均勻分散于去離子水中，并在靜置超過1周后，仍未見明顯沉淀。SEM下觀察，GO呈片狀，可見褶皺的表面形貌，部分GO片層在邊緣折疊翹起；透射電鏡下可清晰地觀察到GO呈輕紗狀半透明微皺的片狀結(jié)構(gòu)，高分辨過濾像中可見該區(qū)域的晶體結(jié)構(gòu)顯示出與石墨一樣的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，見圖1。GO的FTIR結(jié)果顯示，GO中在3400/cm處出現(xiàn)代表-OH的強吸收振動峰，除此之外，在1000/cm～1750/cm，還出現(xiàn)環(huán)氧基、羰基、羧基的吸收峰，見圖2。

2.2 GO-ZrO2支架的合成 不同濃度的GO與硅烷化處理后的ZrO2支架復合后，肉眼可見，復合支架的顏色隨著GO濃度的增高而逐漸加深；支架的三維網(wǎng)狀聯(lián)通結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，未出現(xiàn)明顯的堵孔現(xiàn)象。見圖3。掃描電鏡觀察可見，單純ZrO2支架在低倍電鏡下可見相互聯(lián)通的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，支架骨架表面仍可見細小的裂紋，0.5 mg/mLGO-ZrO2支架未見到明顯的GO片層。高倍電鏡下1.0 mg/mLGO-ZrO2支架可見到薄層的GO沉積在支架骨架的裂紋處，連接裂紋兩端，并且可觀察到陶瓷顆粒表面沉積帶有褶皺的層狀GO。1.5 mg/mLGO-ZrO2復合支架陶瓷顆粒的表面見大量多層GO團聚堆疊。見圖4。因此選擇ZrO2支架與1 mg/mL GO結(jié)合的復合支架（GO-ZrO2）進行下一步實驗。

圖1 鏡下觀察氧化石墨烯形態(tài)Figure 1SEM and TEM images of GO

圖2 氧化石墨烯傅里葉紅外光譜圖Figure 2FTIR spectra of GO

2.3 GO-ZrO2支架的機械性能 機械性能對比結(jié)果顯示，GO-ZrO2支架的壓縮強度為［（1.292±0.087）Mpa］較ZrO2支架［（1.031±0.076）Mpa］顯著增加（P＜0.05）。

2.4 復合支架細胞相容性GO-ZrO2及ZrO2支架上進行細胞培養(yǎng)1、3、5 d后，熒光顯微鏡下觀察細胞骨架，可見細胞有效的黏附于2種支架表面，并可進入支架內(nèi)部，分布均勻。與單純ZrO2支架相比，在GO-ZrO2支架上均可見細胞更為密集的伸展黏附于支架表面，表現(xiàn)出更為活躍的細胞增殖狀態(tài)。見圖5。2種支架上細胞活力檢測結(jié)果進一步證實，hDPSCs在GO-ZrO2支架上培養(yǎng)1、3、5 d時，細胞活力均顯著高于單純ZrO2支架（P＜0.05），見圖6。

圖3 4組支架的光學電子圖Figure 3 Optical pictures of four groups of scaffold

圖4 不同倍數(shù)掃描電鏡下觀察支架表面形貌Figure 4 SEM images at different magnifications of four groups of scaffolds

圖5 熒光顯微鏡下觀察hDPSCs在支架上的細胞形態(tài)Figure 5 Fluorescence microscope images of hDPSCs cultured on ZrO2and GO-ZrO2scaffolds for 1，3，5 days

圖6 hDPSCs在單純ZrO2支架和GO-ZrO2支架上培養(yǎng)5天的增殖情況Figure 6 Cell proliferation of hDPSCs cultured on theZrO2and GO-ZrO2scaffolds for 5 days

3 討 論

理想的骨組織工程支架材料除需要具有一定的機械強度來維持組織形態(tài)外，還需具有良好的生物活性來促進細胞長入和組織整合。本研究采用GO修飾三維ZrO2支架，從而改善復合支架的機械性能并增加支架表面與細胞的親和力；首先采用改良Hummers法制備GO，經(jīng)掃描電鏡及透射電鏡觀察，證實GO為納米薄片狀。其表面及邊緣呈現(xiàn)出起伏的褶皺結(jié)構(gòu)，這是由于較小的薄片允許官能團在邊緣形成氫鍵，為了減少體系的自由能，使片層變形［15］。GO的晶格結(jié)構(gòu)為均勻分散的六元環(huán)狀，這說明在化學處理后，GO仍保留著與石墨一致的完整的晶格結(jié)構(gòu)。FTIR證實了GO含有豐富的含氧基團，其中羰基的存在表明制備過程中發(fā)生了強烈的氧化反應。據(jù)文獻報道，在生物材料應用中，小粒徑及氧化程度高的GO可提高其生物相容性［16］。

為了在ZrO2表面涂覆均勻的GO，需要摸索合適的復合時間和復合濃度，如果提高濃度就必須要延長復合時間，如果延長復合時間就需要降低濃度。根據(jù)文獻查詢和不同預實驗的結(jié)果，本研究選擇0.5、1、1.5 mg/mL3種濃度梯度的GO與ZrO2支架反應1 h，形貌觀察結(jié)果顯示，0.5 mg/mLGO-ZrO2支架表面復合GO較少，存在大面積未復合區(qū)域。1.5 mg/mLGO-ZrO2支架可見GO片層在支架表面團聚堆疊，明顯的改變了其原有納米形貌。而1 mg/mLGOZrO2支架可見到GO均勻涂覆在支架表面，并在裂紋處形成橋接，連接裂紋兩端。綜上所述，在1h的反應時間下，1.0 mg/mL GO與硅烷處理后的ZrO2支架結(jié)合可達到最佳復合效果。復合支架機械性能測試結(jié)果顯示，GO復合后，GO-ZrO2支架的壓縮強度較單純ZrO2支架顯著增加。機械強度的增高得益于GO有效的結(jié)合在復合支架的表面，GO薄片的褶皺紋理可增強基體的機械連鎖和荷載轉(zhuǎn)移；除此之外，GO片層在支架表面原有的微裂紋處沉積，連接裂紋兩端，在壓縮強度測試的外力施加過程中，GO形成的裂紋橋接可阻止裂紋的延伸，從而使復合材料的強度增加［17-18］。

hDPSCs可在GO-ZrO2支架上有效黏附，并均勻分布生長，呈現(xiàn)出活躍的增殖狀態(tài)。這一方面由于GO-ZrO2支架表面具有豐富的含氧基團，使其親水性增加，而親水性的表面有利于細胞早期黏附［19-20］。GO粗糙微褶的納米表面也可增強細胞骨架的張力，提供更強的黏附力［21］。這些因素均有利于防止細胞在GO-ZrO2支架上接種過程中脫落，可提高細胞接種率，進而有利于后期增殖。另一方面也有研究提出，GO可以保護間充質(zhì)干細胞免受活性氧對細胞的損害和細胞凋亡，從而提高細胞的增殖能力［22-23］。

綜上所述，GO修飾三維ZrO2支架后可顯著提高壓縮強度并有利于hDPSCs早期增殖，在頜面部骨缺損修復中展現(xiàn)了良好的應用前景。