肖興寧,汪 雯,張巧艷,張建民,廖 明,楊 華,李延斌

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(杭州), 浙江省植物有害生物防控省部共建國家重點實驗室培育基地,浙江杭州 310021; 2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 3.華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院,廣東廣州 510642; 4.阿肯色大學生物與農(nóng)業(yè)工程系,阿肯色州費耶特維爾 72701)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌,畜禽感染沙門氏菌可引起豬霍亂、雞白痢等疾病,人感染沙門氏菌易造成腹瀉、發(fā)熱及腸道炎癥反應[1-2]。據(jù)統(tǒng)計,我國70%～80%的細菌性食物中毒由沙門氏菌引起,每年病例約820萬[3-4],在引起沙門氏菌中毒的食物中,超過90%是畜禽產(chǎn)品[1-2]。調(diào)查顯示,我國生鮮零售雞肉中沙門氏菌平均污染率為52.3%[5]。肉雞屠宰環(huán)節(jié)的沙門氏菌交叉污染不容忽視,有研究表明,進入屠宰場活禽沙門氏菌污染率為3%～4%時,屠宰后污染率可升高至35%[6-7]。因此,減少屠宰加工環(huán)節(jié)微生物交叉污染,對保障產(chǎn)品安全具有重要意義。

肉雞屠宰加工過程包括淋雞、掛雞、宰殺、瀝血、浸燙、脫毛、掏膛、內(nèi)腔淋洗、預冷清洗等多個環(huán)節(jié),其中,預冷清洗水中殘留的細菌可遷移至未污染的雞肉表面,發(fā)生交叉污染,因此需在預冷水中添加殺菌劑進行控制[8-9]。NaClO是一種高效廣譜的殺菌劑,其殺菌原理是其可在水中形成次氯酸,同細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化反應或破壞磷酸脫氫酶結(jié)構(gòu),使糖代謝失調(diào)而至細胞死亡[10-11]。在我國,NaClO是屠宰企業(yè)清洗環(huán)節(jié)的常用殺菌劑[12]。

目前,交叉污染研究主要集中在定量描述不同介質(zhì)間的細菌遷移數(shù)量,如豬舌在廚房切片過程中單增李斯特菌的交叉污染遷移數(shù)量[13],火腿在切片過程中基于遷移數(shù)量的交叉污染模型[14],以及在廚房加工中,雞肉中彎曲桿菌遷移數(shù)量的交叉污染模型[15]。關于交叉污染造成細菌污染率變化的研究較少。Jung等[16]用自來水、電解水、乳酸、檸檬酸等4種清洗方法對初始污染率為12.5%的萵苣進行連續(xù)3批次清洗,計算每批次萵苣清洗后的細菌污染率。

交叉污染造成細菌污染率的變化是風險評估模型中的重要輸入?yún)?shù)。雞肉沙門氏菌風險評估模型中鮮見預冷清洗交叉污染造成細菌污染率變化的相關數(shù)據(jù),NaClO濃度和初始污染率對多批次樣品清洗后沙門氏菌污染率的影響尚不明確[17-19]。因此,本實驗模擬不同NaClO濃度(0～70 mg/L)和初始污染率(25%～100%)條件下3批次雞肉清洗過程,研究清洗后雞肉沙門氏菌污染率與NaClO濃度的關系,為優(yōu)化預冷清洗工藝和雞肉沙門氏菌定量風險評估提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(Brain Heart Infusion Broth,BHI)、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water,BPW)、木糖-賴氨酸-硫酸四癸鈉瓊脂(Xylose Lysine Tergitol 4,XLT4)培養(yǎng)基 美國BD公司;亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(Selenite Cystine Broth,SC) 青島海博生物技術公司;NaClO溶液 生工生物工程(上海)股份有限公司;斯坦利沙門氏菌(Salmonellastanley)、印第安納沙門氏菌(Salmonellaindiana)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、湯卜遜沙門氏菌(Salmonellathompson)、肯塔基沙門氏菌(Salmonellakentucky) 五株菌均分離于廣州某屠宰場,菌株保存于含有20%甘油的腦心浸液肉湯中,儲存于-80 ℃冰箱備用,由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院提供;雞胸肉 購置于浙江省杭州市樂購超市。

Thermo Fisher 1389生物安全柜 英國Waltham公司;HVA-85 高壓滅菌鍋 日本Hirayama公司;KB240恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國Binder公司;Seward 400拍打式均質(zhì)機 英國Seward公司;WASP 2螺旋接種儀 英國Don Whitley Scientific公司;ProtoCOL3全自動細胞計數(shù)儀 英國Synbiosis公司;10～1000 μL移液槍 德國Eppendorf公司;CS180百靈達余氯傳感儀 英國Palintest公司;CR400手持式色差儀 日本ChromaMeter公司;Hitachi 7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;TX150水浴鍋 英國Grant公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞肉的預處理 雞胸肉冰鮮運至實驗室,切塊分裝于自封袋中,單塊重量約25 g(5 cm×3 cm×2 cm),儲存于-20 ℃冰箱內(nèi)。實驗前取出放置于4 ℃冰箱解凍并在生物安全柜中紫外滅菌30 min后備用。紫外滅菌后的雞肉樣本中未有沙門氏菌檢出。

1.2.2 菌懸液制備及雞肉接種 5株菌株分別接種至5 mL BHI液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,將菌液等體積均勻混合,制得25 mL菌種原液,約9 lg CFU/mL。用BPW稀釋菌種原液,使初始接種液濃度約為7lg CFU/mL。將雞肉浸泡于接種液中30 min,轉(zhuǎn)移至無菌稱量盤,在生物安全柜內(nèi)靜置30 min,確保細菌附著在雞肉表面。雞肉表面初始接種水平約為5lg CFU/g。

1.2.3 雞肉預冷清洗

1.2.3.1 不同濃度NaClO的預冷清洗 實驗前,將水浴鍋水溫調(diào)節(jié)至4 ℃。分別取濃度為0.8 g/mL的NaClO溶液0、238、595、833 μL溶于1 L預冷水中,制備NaClO濃度為0、20、50、70 mg/L的預冷水,不含NaClO的預冷水清洗為對照組。以對照組為例,將4塊接種后的雞肉(初始污染率為100%)放入NaClO濃度為0 mg/L的燒杯中清洗20 min后取出;不更換預冷水,將第二批共4塊無菌雞肉放入水中清洗20 min;再將第三批共4塊無菌雞肉放入預冷水中清洗20 min,即完成雞肉初始污染率為100%,NaClO濃度為0 mg/L的3批次雞肉連續(xù)預冷清洗。20、50、70 mg/L NaClO預冷水清洗過程同對照組操作,整個實驗重復3次。

1.2.3.2 不同初始污染率的預冷清洗 研究3種初始污染率(25%、50%、100%)雞肉預冷清洗(NaClO濃度為50 mg/L)后的細菌污染率,不含NaClO的預冷水清洗為對照組。以初始污染率為25%,NaClO濃度為0 mg/L實驗為例,將含有1塊接種雞肉的4塊雞肉(初始污染率為25%)放入NaClO濃度為0 mg/L的預冷水中清洗20 min后取出;不更換預冷水,將第二批共4塊無菌雞肉放入水中清洗20 min;再將第三批共4塊無菌雞肉放入預冷水中清洗20 min,即完成初始污染率為25%,NaClO濃度為0 mg/L的3批次雞肉連續(xù)預冷清洗。其余5組(25%,50 mg/L;50%,0 mg/L;50%,50 mg/L;100%,0 mg/L;100%,50 mg/L)清洗實驗操作同對照組處理,整個實驗重復3次。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 預冷水中細菌測定 取1 mL清洗后預冷水于無菌離心管,充分震蕩后,吸取50 μL采用螺旋涂布法涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h,使用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)。當樣本中細菌濃度低于涂布法定量限(20 CFU/mL)時,采用增菌富集法定性測定樣本中是否含有沙門氏菌殘留。取1 mL預冷水至9 mL SC增菌液中,37 ℃,12 h培養(yǎng)后吸取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判定預冷水中有沙門氏菌殘留。

1.2.4.2 清洗后雞肉污染率測定 清洗后雞肉樣本轉(zhuǎn)移至含有25 mL BPW的均質(zhì)袋中,以250 r/min速度拍打1 min,取1 mL均質(zhì)液至9 mL SC增菌液中,37 ℃培養(yǎng)12 h。取10 μL增菌液涂布于XLT4瓊脂培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h,若平板長出黑色菌落,則判斷為沙門氏菌陽性樣本。每批次雞肉清洗后沙門氏菌污染率(Pn,%)及雞肉全部清洗后總污染率(P,%)計算如公式(1)～(2)所示。

式(1)

式中:Mn第n批次雞肉清洗后沙門氏菌陽性樣本量(n=0,1,2,3),Nn為每批次雞肉樣本量。當n=0時,P0為初始污染率即第一批次雞肉清洗前細菌污染率(%);當n=1時,P1為第一批次雞肉清洗后的細菌污染率(%);當n=2時,P2為第二批次雞肉清洗后的細菌污染率(%);當n=3時,P3為第三批次雞肉清洗后的細菌污染率(%)。

式(2)

式中:M為3批次雞肉全部清洗后的沙門氏菌陽性樣本量,N為3批次雞肉樣本總量。

1.2.4.3 雞肉色澤測定 本實驗測定了第一批雞肉NaClO(0、20、50、70 mg/L)預冷清洗前后的色澤變化。以色差儀測量雞肉表面的色澤變化指標值(ΔL,Δa,Δb)。其中,ΔL表示亮度值,Δa表示紅度值,Δb表示黃度值。每個樣品平行測定5次,整個實驗重復3次。

1.2.4.4 透射電子顯微鏡樣品制備與觀察 為研究細菌在不同濃度NaClO處理下的細胞損傷程度。雞肉在0、20、50、70 mg/L的NaClO中清洗后取出,用刀片在雞肉樣本上取尺寸為3 mm×1 mm×1 mm大小的雞肉塊。采用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨雙重固定雞胸肉樣品,乙醇梯度脫水,樹脂包埋,切片后經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色,透射電子顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標準差”表示,采用Origin 8.1軟件進行作圖分析。采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析,通過一元方差分析(Oneway ANOVA)進行多個組間平均數(shù)的比較。若組間存在顯著性差異,采用Duncan檢驗進行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaClO濃度對清洗后雞肉沙門氏菌污染率的影響

由表1可知,當預冷水中未添加NaClO時,第一批雞肉清洗后污染率仍為100%,第二、三批無菌雞肉清洗后污染率分別為91.7%和83.3%,表明低溫清洗(4 ℃)對沙門氏菌交叉污染抑制效果不明顯,細菌可通過預冷水遷移至后續(xù)清洗的雞肉樣本[21]。添加NaClO后,沙門氏菌通過預冷水遷移至第二批雞肉的概率降低,且第三批無菌雞肉在20～70 mg/L的NaClO中清洗后未發(fā)生沙門氏菌污染,表明NaClO可一定程度上減少預冷水中細菌殘留量,從而減少細菌遷移[16]。對預冷水中細菌污染水平測定結(jié)果顯示(表2),當未添加NaClO時,清洗后預冷水中沙門氏菌的污染水平為4lg CFU/mL。當NaClO濃度為20 mg/L時,清洗后預冷水中沙門氏菌污染水平低于定量限(20 CFU/mL),但增菌后有沙門氏菌檢出。當NaClO濃度為50和70 mg/L時,增菌后預冷水中未檢出沙門氏菌?？梢?預冷水中NaClO濃度(50 mg/L時,可有效抑制多批次雞肉清洗過程的交叉污染。

表1 不同NaClO濃度清洗后的雞肉沙門氏菌污染率(%)Table 1 Post-chill prevalence of Salmonella on chicken samples at different chlorine concentration(%)

表2 雞肉全部清洗后的預冷水中的細菌存活數(shù)量Table 2 Bacterial survival in chilling water

2.2 初始污染率對交叉污染的影響

由表3可知,當預冷水中未添加NaClO和NaClO添加濃度為50 mg/L時,樣品初始污染率對交叉污染影響均不顯著(p>0.05)。未添加NaClO時,各種初始污染率的雞肉清洗后污染率均較高;NaClO添加濃度為50 mg/L時,可控制各種初始污染率雞肉樣品在清洗中的交叉污染。Maffei等[22]研究了沙門氏菌污染率分別為9.0%、16.7%、50.0%的生菜清洗后的細菌污染率變化,同樣未發(fā)現(xiàn)初始污染率對交叉污染的影響。Yang等[21]的研究也表明NaClO濃度為50 mg/L時,可有效控制預冷清洗中初始污染率為3.0%～43.3%雞肉沙門氏菌的交叉污染。

表3 不同初始污染率條件下清洗后的雞肉沙門氏菌污染率Table 3 Post-chill prevalence of Salmonella on chicken samples at different initial pre-chill prevlence

2.3 NaClO清洗對雞肉色澤的影響

不同濃度NaClO清洗后的雞肉色澤變化如表4所示。清洗后的雞肉表面亮度值、紅度值、黃度值未發(fā)生顯著性變化(p>0.05),表明預冷清洗中使用濃度低于70 mg/L NaClO,不會造成雞肉色澤變化。NaClO氧化性對食品色澤影響可能與濃度和食品基質(zhì)相關。王凱利等[23]研究發(fā)現(xiàn)250 mg/L NaClO處理對雞肉色澤變化沒有顯著性影響。孫靜等[24]研究發(fā)現(xiàn),1000 mg/L NaClO處理后鴨蛋殼的表面亮度顯著增大。

表4 雞肉處理前后色澤變化Table 4 Changes in color of chicken samples treated with different NaClO concentrations

2.4 NaClO清洗后雞肉表面細菌透射電鏡圖

不同濃度NaClO(0、20、50、70 mg/L)處理后的雞肉表面沙門氏菌細胞狀態(tài)如圖1所示,0 mg/L的NaClO處理后的沙門氏菌細胞壁及細胞膜結(jié)構(gòu)完整,電子密度較高,胞漿內(nèi)電子密度均一(圖1A)。經(jīng)20、50、70 mg/L的NaClO處理后,細菌細胞壁和胞漿內(nèi)電子密度均降低，菌體細胞壁及細胞膜斷裂,核心溶解(圖1B～圖1D)[25]，菌體均受到一定程度的破壞。

圖1 不同濃度NaClO處理下的沙門氏菌透射電鏡圖(5000×)Fig.1 Transmission electron microscope photographs of Salmonella treated with different concentrations of NaClO(5000×)注：A、B、C、D分別是0、20、50、70 mg/mL NaClO處理的沙門氏菌。

3 討論與結(jié)論

交叉污染是造成食品致病菌污染、引發(fā)食品安全事件的重要因素之一[26],加強交叉污染對食品中細菌污染率、污染水平變化規(guī)律的研究,對開展微生物風險評估具有重要意義。本研究針對雞肉屠宰預冷清洗環(huán)節(jié)的連續(xù)清洗過程,研究了NaClO濃度(0～70 mg/L)和初始污染率(25%～100%)對交叉污染的影響,發(fā)現(xiàn)添加NaClO可有效抑制多批次雞肉清洗過程中的沙門氏菌交叉污染,且濃度≥50 mg/L時,預冷水中無沙門氏菌殘留,可減小交叉污染風險。

目前,肉雞沙門氏菌的定量風險評估模型普遍未考慮預冷環(huán)節(jié)多批次清洗過程中交叉污染造成的沙門氏菌污染率變化。Yang等[21]研究了單批次預冷清洗中不同氯濃度清洗后的雞肉沙門氏菌污染率變化,不適用于多批次清洗的交叉污染情況。Whyte等[27]評價了二氯異氰尿酸鈉在肉雞預冷清洗過程中對交叉污染的控制效果,Park等[28]研究了電解水對肉禽清洗中彎曲桿菌交叉污染的控制效果,然而,在我國肉雞屠宰質(zhì)量管理規(guī)范中(NY/T 1174-2006),NaClO是唯一允許在屠宰預冷環(huán)節(jié)使用的殺菌劑。前人的研究均無法為我國肉雞屠宰沙門氏菌風險評估模型提供數(shù)據(jù)基礎。因此,本研究對我國肉雞預冷清洗環(huán)節(jié)沙門氏菌污染控制、開展沙門氏菌定量風險評估具有重要意義。本研究為實驗室模擬實驗,未來需在中試規(guī)模下進行大樣本驗證。此外,本研究未涉及清洗后雞肉細菌污染率與清洗批次、氯濃度及初始污染率等因素之間的定量模型,需在下一步研究中進行探索。