王占一,李卓瓦,畢海丹,王 飛,王京龍,向 蘭

(1.棗莊學(xué)院食品科學(xué)與制藥工程學(xué)院,山東棗莊 277160; 2.山東大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250012)

人體所含的微量元素中,硒是必不可少的,能夠提高人體非特異性免疫能力、能夠預(yù)防惡性腫瘤、溶血性貧血、克山病等多種疾病[1]。生物利用度較高的有機(jī)硒通常以硒多糖、硒蛋白和硒核酸等形式存在,其中硒多糖,即元素硒與多糖的合成產(chǎn)物,是理想的補(bǔ)硒產(chǎn)品,在人體內(nèi)能發(fā)揮元素硒與多糖雙重生理活性[2-3]。然而,自然界中的富硒多糖含量極少,富硒栽培所得的硒多糖,存在硒含量不高等不足,難以得到理想的硒多糖。因此,國內(nèi)外學(xué)者致力于富硒多糖的制備及生物活性方面的研究[4]。張繼等[5]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法將蘭州百合多糖制備成多糖硒酸酯,通過拉曼光譜和熱重分析等鑒定發(fā)現(xiàn),硒在合成產(chǎn)物中以Se=O鍵形式存在;顏炳祥等[6]研究發(fā)現(xiàn),硒化后的乳酸菌胞外多糖對(duì)羥基自由基的清除能力顯著增強(qiáng);李華為等[7]研究發(fā)現(xiàn),蛹蟲草硒化多糖對(duì)羥基自由基的清除效果好于過氧化氫酶。

石榴(PunicagranatumL.)是亞熱帶地區(qū)常見樹種,全球各地區(qū)均有廣泛分布[8]。果實(shí)成熟后的種子,即石榴籽是石榴果品的主要副產(chǎn)品之一,近年來,關(guān)于石榴籽中生物活性成分的研究報(bào)道較多,郭傳琦等[9]采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對(duì)石榴籽中多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)石榴籽中多糖成分含量較高;楊麗娜等[10]和張立華等[11]研究證實(shí),石榴籽提取物中多糖及多酚類成分,具有較強(qiáng)的清除自由基能力,對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷保護(hù)作用效果明顯。但是,關(guān)于石榴籽多糖硒酸酯合成工藝優(yōu)化、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析和抗氧化等方面的研究,國內(nèi)尚未見報(bào)道。

鑒于此,本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中[12],以果膠酶、纖維素酶和甘露聚糖酶作為復(fù)合酶組成,采用復(fù)合酶解法提取,并經(jīng)過后期純化得到純度較高的石榴籽多糖成分。本實(shí)驗(yàn)以石榴籽多糖和亞硒酸鈉為合成原料,稀硝酸和氯化鋇為催化劑,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化了石榴籽多糖硒酸酯的合成工藝條件,并對(duì)合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和抗油脂氧化能力進(jìn)行研究,以期為石榴籽多糖硒酸酯的工業(yè)化生產(chǎn)及開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴籽多糖 多次純化得均一多糖,棗莊學(xué)院生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心提供;硒粉標(biāo)準(zhǔn)品 純度>99.99%,上海博頓生物化工有限公司;天然大豆油 市售;豬油 自制;硝酸、亞硒酸鈉、抗壞血酸、無水乙醇、丙酮、鹽酸、氨水、氯化銨、氯化鋇、鄰苯二胺鹽酸鹽、甲苯、高氯酸、硫酸鈉、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、溴化鉀、硫代硫酸鈉、淀粉指示劑、吐溫-60、硫酸 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;蒸餾水 棗莊學(xué)院生物學(xué)省級(jí)教學(xué)示范中心提供。

VERTEX-80V型真空傅里葉變換紅外光譜儀 德國BRUKER公司;STA409PC型同步熱分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司;UV-4802S型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司;LGJ-18A型冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司;FA1104B型電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;HH-4型電熱恒溫水浴鍋 上海谷寧儀器有限公司;HTP201C型恒溫恒濕試驗(yàn)箱 北京環(huán)創(chuàng)科學(xué)儀器有限公司;8000 dol透析袋 上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2 石榴籽多糖硒酸酯中硒含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 將硒粉標(biāo)準(zhǔn)品于105 ℃恒溫干燥至恒重,精密稱取25.00 mg置于50 mL燒杯中,用適量HNO3消化至溶液澄清后,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,以重蒸餾水定容,作為備用液。精密量取備用液2.0 mL,用重蒸餾水定容至500 mL,即為硒對(duì)照品溶液(濃度為4 μg/mL)。取硒對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL,分別置于50 mL小燒杯中,加重蒸餾水25 mL,用0.5% HCl調(diào)pH=2,再加入2%鄰苯二胺鹽酸鹽溶液1.0 mL,充分?jǐn)嚢?靜置2 h,轉(zhuǎn)移至100 mL分液漏斗中,用甲苯萃取2次,每次10 mL,分取甲苯層,轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中,并用甲苯定容至刻度。以不加硒對(duì)照品的溶液作對(duì)照,在334 nm波長下測(cè)定吸光值(A值),并以A值為縱坐標(biāo),系列濃度(C值)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為:A=0.2025C+0.0839,相關(guān)系數(shù)r=0.9993,硒含量在0～1.96 μg/mL范圍內(nèi)與A值呈良好線性關(guān)系[16-17]。

1.2.2.2 樣品硒含量的測(cè)定 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各20 mg,分別置于50 mL小燒杯中,加入混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)3 mL消化至液體無色后,將小燒杯置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱2 h,冷卻至室溫后,加重蒸餾水25 mL,按照1.2.2.1項(xiàng)下方法處理后測(cè)定A值,計(jì)算石榴籽多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量及收率[16-17]。

式中:m1為石榴籽多糖硒酸酯的質(zhì)量,mg;m2為石榴籽多糖的質(zhì)量,mg。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 原料配比對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 改變石榴籽多糖和Na2SeO3的質(zhì)量比,使其分別為1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.4,反應(yīng)時(shí)間8 h,硝酸濃度為0.6%,反應(yīng)溫度75 ℃,按1.2.1項(xiàng)下方法合成多糖硒酸酯,以產(chǎn)物硒含量及收率為指標(biāo),考察原料配比對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響。

1.2.3.2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 改變反應(yīng)溫度,使其分別為45、55、65、75、85、95 ℃,原料配比1∶1.0,硝酸濃度為0.6%,加熱時(shí)間8 h,按1.2.1項(xiàng)下方法合成多糖硒酸酯,以產(chǎn)物硒含量及收率為指標(biāo),考察反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響。

1.2.3.3 硝酸濃度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 改變硝酸濃度,使其分別為0.30%、0.45%、0.60%、0.75%、0.90%、1.05%,原料配比1∶1.0,反應(yīng)溫度75 ℃,加熱時(shí)間8 h,按1.2.1項(xiàng)下方法合成多糖硒酸酯,以產(chǎn)物硒含量及收率為指標(biāo),考察硝酸濃度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響。

1.2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 改變反應(yīng)時(shí)間,使其分別為2、4、6、8、10、12 h,原料配比1∶1.0,反應(yīng)溫度 75 ℃,硝酸濃度為0.6%,按1.2.1項(xiàng)下方法合成多糖硒酸酯,以產(chǎn)物硒含量及收率為指標(biāo),考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì),以原料配比、反應(yīng)溫度、硝酸濃度和反應(yīng)時(shí)間為自變量,以石榴籽多糖硒酸酯產(chǎn)物硒含量和產(chǎn)物收率為響應(yīng)值優(yōu)化合成工藝條件[18-19],因素水平表見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 1 Level and factors table of response surface experiment

1.2.5 石榴籽多糖硒酸酯的結(jié)構(gòu)分析

1.2.5.1 紫外光譜分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各20 mg,分別置于50 mL小燒杯中,加入混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)3 mL消化至液體無色后,將小燒杯置于95 ℃水浴鍋中恒溫加熱2 h,冷卻至室溫,加重蒸餾水25 mL,按照1.2.2.1項(xiàng)下方法處理后,應(yīng)用紫外-可見分光光度計(jì),在300～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,分析合成產(chǎn)物的特征基團(tuán)[5,15]。

1.2.5.2 紅外光譜分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各10 mg,加入干燥的KBr,攪拌均勻,在瑪瑙研缽中研磨壓片,應(yīng)用真空型傅里葉變換紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描,分析合成產(chǎn)物的特征基團(tuán)[14-16]。

1.2.5.3 差熱分析 稱取石榴籽多糖硒酸酯及未修飾的石榴籽多糖各10 mg,適當(dāng)處理后,應(yīng)用同步熱分析儀進(jìn)行熱重掃描,比較二者結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化。升溫速率10 ℃/min,升溫范圍25～700 ℃,氣氛為靜態(tài)氮?dú)?參比物為Al2O3[5,14-15]。

1.2.6 石榴籽多糖硒酸酯的抗油脂氧化能力試驗(yàn)

1.2.6.1 石榴籽多糖硒酸酯對(duì)植物油脂的抗氧化試驗(yàn) 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg,蒸餾水1.5 mg(空白對(duì)照)和抗壞血酸1.5 mg(陽性對(duì)照)分別置于100 mL小燒杯中,依次加入5.0 mL重蒸餾水和0.5 g吐溫-60,50 mL大豆油,攪拌均勻后,放入(60±1) ℃恒溫恒濕試驗(yàn)箱中保存,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16 d取樣1.5～2 g測(cè)定其過氧化值(POV,mmol/kg),比較不同加入量的石榴籽多糖硒酸酯對(duì)植物油脂的抗氧化作用[11,20-21]。

1.2.6.2 石榴籽多糖硒酸酯對(duì)動(dòng)物油脂的抗氧化試驗(yàn) 精密稱取石榴籽多糖硒酸酯0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg,蒸餾水1.5 mg(空白對(duì)照)和VC1.5 mg(陽性對(duì)照)分別置于100 mL小燒杯中,依次加入5.0 mL重蒸餾水、0.5 g吐溫-60、40 g豬油,攪拌均勻后,放入(60±1) ℃恒溫恒濕試驗(yàn)箱中保存,分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16 d取樣1.5～2 g測(cè)定POV值,比較不同加入量的石榴籽多糖硒酸酯對(duì)動(dòng)物油脂的抗氧化作用[11,20-21]。

1.2.6.3 抗油脂氧化能力評(píng)價(jià) 準(zhǔn)確稱取1.2.5.1和1.2.5.2項(xiàng)下所取試樣1.5～2 g于250 mL錐形瓶中,加入三氯甲烷-冰乙酸(體積比為1∶1)混合溶液30 mL,飽和KI溶液1 mL,封口,搖勻后置于暗處5 min,加入蒸餾水100 mL,搖勻后立即用0.002 mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,待溶液呈現(xiàn)淡黃色時(shí),加入淀粉指示劑1 mL,繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為止,計(jì)算POV數(shù)值[11,20,22-23]。

式中:V1為試樣消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;V0為空白對(duì)照試樣消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液體積,mL;C為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的濃度,mol/L;m為試樣的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Box-Behnken設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件,圖形制作采用Excel和Origin Pro 8.0數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 原料配比對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響Fig.1 Effects of raw material ratio on contents and yields of Se

2.1.2 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 圖2為反應(yīng)溫度對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響。由圖2可知,隨著反應(yīng)溫度的提高,產(chǎn)物硒含量及收率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),當(dāng)溫度超過75 ℃時(shí),隨著反應(yīng)溫度的提高,產(chǎn)物硒含量及收率呈現(xiàn)下降趨勢(shì),原因可能是該合成反應(yīng)是一個(gè)吸熱過程,溫度較低時(shí),不利于反應(yīng)的進(jìn)行,溫度較高時(shí),多糖的羥基被加速氧化,糖苷鍵裂解也將加快,因而嚴(yán)重影響了有機(jī)硒的穩(wěn)定性。因此,反應(yīng)溫度應(yīng)該控制在75 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響Fig.2 Effects of reaction temperature on contents and yields of Se

2.1.3 硝酸濃度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 圖3為硝酸濃度對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響。由圖3可知,硝酸作為合成反應(yīng)的催化劑,其濃度對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響很大,隨著硝酸濃度的增大,二者均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)硝酸濃度為0.60%時(shí),二者均達(dá)到最大值,當(dāng)硝酸濃度超過0.75%時(shí),產(chǎn)物硒含量及收率下降明顯,原因可能是硝酸具有強(qiáng)氧化性,其濃度較低時(shí),催化效果不明顯,濃度較高時(shí),多糖的羥基被氧化或糖苷鍵裂解,破壞了合成產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此,硝酸濃度應(yīng)控制在0.60%左右。

圖3 硝酸濃度對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響Fig.3 Effects of concentration of HNO3on contents and yields of Se

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物硒含量及收率的影響 圖4為反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響。由圖4可知,隨著硝酸濃度的增大,硒含量及收率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。反應(yīng)時(shí)間2～8 h時(shí),合成反應(yīng)時(shí)間越長,產(chǎn)物硒含量及收率越高,但是當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過8 h時(shí),產(chǎn)物硒含量及收率不再升高,反而呈現(xiàn)減少趨勢(shì),原因可能是,反應(yīng)時(shí)間延長,促進(jìn)了多糖的降解,嚴(yán)重影響了有機(jī)硒的穩(wěn)定性。因此,反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該控制在8 h左右。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)合成產(chǎn)物硒含量及收率的影響Fig.4 Effects of reaction time on contents and yields of Se

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,將原料配比、反應(yīng)溫度、硝酸濃度和反應(yīng)時(shí)間依次編碼為X1、X2、X3、X4作為自變量,其編碼值1、0、-1分別代表自變量的高、中低水平,以合成產(chǎn)物硒含量(Y1)和收率(Y2)作為響應(yīng)值,應(yīng)用Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)分析軟件建立回歸數(shù)學(xué)模型,Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

通過對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到合成產(chǎn)物硒含量(Y1)和收率(Y2)的四元二次回歸方程如下:

式(1)

式(2)

方程式(1)顯著性檢驗(yàn)與方差分析結(jié)果見表3。從方差分析結(jié)果可知,回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9078,p<0.0001,模型極顯著,說明模型能夠反映響應(yīng)值的變化,回歸方程適用于合成產(chǎn)物硒含量的理論預(yù)測(cè)。失擬項(xiàng)p=0.0661,影響不顯著,說明殘差是由隨機(jī)誤差引起?；貧w方程的一次項(xiàng)X1、X2、X4,交互項(xiàng)X3X4對(duì)產(chǎn)物硒含量的影響均達(dá)到顯著水平(p<0.05),X3以及二次項(xiàng)X12、X42均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),說明響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜,試驗(yàn)因素對(duì)產(chǎn)物硒含量的影響并不是簡單的線性關(guān)系[18-19]。

表3 產(chǎn)物硒含量回歸方程的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of regression equation for contents of Se

方程式(2)顯著性檢驗(yàn)與方差分析結(jié)果見表4。從方差分析結(jié)果可知,回歸模型的決定系數(shù)R2=0.9105,p<0.0001,說明模型能夠反映響應(yīng)值的變化,回歸方程適用于合成產(chǎn)物收率的理論預(yù)測(cè)。失擬項(xiàng)p=0.0583,影響不顯著,說明殘差具有隨機(jī)誤差引起。回歸方程的交互項(xiàng)X1X3對(duì)產(chǎn)物收率的影響達(dá)到顯著水平(p<0.05),一次項(xiàng)X4以及二次項(xiàng)X12、X22、X42均達(dá)到極顯著水平(p<0.01),同樣說明試驗(yàn)因素對(duì)產(chǎn)物收率的影響并不是簡單的線性關(guān)系[19]。

表4 產(chǎn)物收率回歸方程的方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of regression equation for product yield

經(jīng)過Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)軟件分析,得出制備石榴籽多糖硒酸酯的最佳工藝條件為:原料配比1∶1.02,反應(yīng)溫度76.20 ℃,硝酸濃度0.74%,反應(yīng)時(shí)間9.30 h,在此工藝條件下,合成產(chǎn)物硒含量的模型預(yù)測(cè)值為4.134 mg/g,產(chǎn)物收率的模型預(yù)測(cè)值為42.720%。實(shí)際操作中稍作調(diào)整,確定的最佳工藝條件為:原料配比1∶1.02,反應(yīng)溫度76 ℃,硝酸濃度0.74%,反應(yīng)時(shí)間9.3 h。在最佳工藝條件下進(jìn)行5次平行試驗(yàn),測(cè)得合成產(chǎn)物硒含量為(4.117±0.02) mg/g,產(chǎn)物收率為42.596%±0.13%,偏差均小于0.5%,說明本工藝參數(shù)具有很好的穩(wěn)定性[18]。

2.3 合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 紫外光譜分析 圖5為石榴籽多糖(A)和合成產(chǎn)物(B)的紫外光譜。由圖5可以看出,合成產(chǎn)物(B)在波長334 nm處具有一個(gè)很強(qiáng)吸收峰,與文獻(xiàn)[24]報(bào)道硒元素在波長334 nm處所引起的吸收峰一致,而石榴籽多糖(A)在300～400 nm波長范圍內(nèi)無吸收峰,證明了硒元素存在于合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中[5,15]。

圖5 石榴籽多糖(A)和合成產(chǎn)物(B)的紫外光譜Fig.5 UV of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.3.2 紅外光譜分析 圖6中A為石榴籽多糖的紅外光譜圖,在3422.64 cm-1處出現(xiàn)O-H的伸縮振動(dòng)峰;在1618.31 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)峰,為多糖結(jié)構(gòu)中C=O的伸縮振動(dòng)峰;在1141.52～1027.18 cm-1處出現(xiàn)吸收峰,為多糖結(jié)構(gòu)中C-O的兩種伸縮振動(dòng)峰。B為合成產(chǎn)物的紅外光譜圖,其吸收峰的波形、吸收強(qiáng)度和峰寬等指標(biāo)與石榴籽多糖一致,說明合成產(chǎn)物的骨架結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變,仍然具備石榴籽多糖的固有特征。不同的是,合成產(chǎn)物的紅外光譜圖在950.06、896.27、764.85 cm-1處出現(xiàn)了3個(gè)特征吸收峰,依次歸屬為合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中Se=O、C-Se和Se-O的伸縮振動(dòng)峰,充分證明了硒元素存在于合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)中[14-16]。

圖6 石榴籽多糖(A)和合成產(chǎn)物(B)的紅外光譜Fig.6 IR of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.3.3 差熱分析 圖7a為石榴籽多糖及其合成產(chǎn)物的TG峰,將二者失重過程均分為4個(gè)階段,第1階段為失去吸附水階段,基本在100 ℃前結(jié)束,二者峰形大體相同;第2階段為緩慢失重階段,石榴籽多糖在100～245.5 ℃范圍內(nèi)失重量為7.7%,而合成產(chǎn)物在此范圍內(nèi)失重量為8.4%,二者的失重情況大體相同;第3階段為快速失重階段,石榴籽多糖在245.5～425.5 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)快速失重現(xiàn)象,失重達(dá)到54.2%,而合成產(chǎn)物在此范圍內(nèi)的失重率峰型更加陡峭,失重達(dá)到76.1%,說明合成產(chǎn)物的穩(wěn)定性降低;第4階段為后失重階段,石榴籽多糖在425.5～600 ℃內(nèi)失重為16.9%;而合成產(chǎn)物在此范圍內(nèi)失重僅為4.5%,且在600 ℃前已經(jīng)基本分解完全,說明合成產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性較差,原因可能是:石榴籽多糖硒酸酯分子中引入亞硝酸基,改變了石榴籽多糖固有的分子結(jié)構(gòu),亞硝酸基的存在使得產(chǎn)物在較高溫度下更容易脫水裂解,穩(wěn)定性降低[5,14-15]。

圖7b為石榴籽多糖及其合成產(chǎn)物在氮?dú)猸h(huán)境中的熱勢(shì)圖,二者的失重過程均為放熱反應(yīng),均未體現(xiàn)出明顯的氧化過程,因此,二者的失重過程均為單一的熱裂解反應(yīng)。

圖7 石榴籽多糖(A)和合成產(chǎn)物(B)的熱分析Fig.7 Thermogravimetric analysis of polysaccharide of pomegranate seeds and synthetic product

2.4 合成產(chǎn)物抗油脂氧化能力分析

2.4.1 合成產(chǎn)物抗植物油脂氧化能力分析 由圖8可知,植物油脂在(60±1) ℃高溫誘導(dǎo)后,發(fā)生了氧化反應(yīng),在烘箱中放置的時(shí)間越長,POV值越大,表明烘箱能夠使植物油脂自氧化反應(yīng)加劇[20,25]。當(dāng)添加合成產(chǎn)物后,5組不同添加量的油樣其POV值與空白對(duì)照組相比明顯下降,且隨著添加量的增加,抗植物油脂氧化能力增強(qiáng),具有明顯的量效對(duì)應(yīng)關(guān)系,且時(shí)間越長,效果越顯著,合成產(chǎn)物添加量達(dá)到2.0 mg的油樣,其抗氧化能力接近添加1.5 mg VC所達(dá)到的效果。

圖8 合成產(chǎn)物抗植物油脂氧化能力Fig.8 Antioxidant capacity of synthetic product against vegetable oil

2.4.2 合成產(chǎn)物抗動(dòng)物油脂氧化能力分析 由圖9可知,動(dòng)物油脂在(60±1) ℃高溫誘導(dǎo)后,同樣發(fā)生了氧化反應(yīng),時(shí)間越長,空白對(duì)照組的POV值越大,表明烘箱同樣能夠加快動(dòng)物油脂的自氧化反應(yīng)。動(dòng)物油脂中添加合成產(chǎn)物后,其抗氧化活性比空白對(duì)照組明顯增強(qiáng),5組不同添加量的油樣,均具有抗氧化效果,且隨著添加量的增加,抗動(dòng)物油脂氧化能力增強(qiáng),量效對(duì)應(yīng)關(guān)系比較顯著。

圖9 合成產(chǎn)物抗動(dòng)物油脂氧化能力Fig.9 Antioxidant capacity of synthetic product against animal oil

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以石榴籽多糖和亞硒酸鈉為原料,稀硝酸和氯化鋇為催化劑,合成了石榴籽多糖硒酸酯,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化合成工藝參數(shù)為:原料配比1∶1.02,反應(yīng)溫度76 ℃,硝酸濃度0.74%,反應(yīng)時(shí)間9.3 h,該工藝條件下,測(cè)得合成產(chǎn)物硒含量為(4.117±0.02) mg/g,產(chǎn)物收率為42.596%±0.13%;合成產(chǎn)物經(jīng)過紫外光譜、紅外光譜和熱重分析,充分證明了硒元素存在于石榴籽多糖硒酸酯的結(jié)構(gòu)中。油脂抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明,合成產(chǎn)物能夠明顯減緩植物油脂和動(dòng)物油脂POV值升高趨勢(shì),且具有一定的濃度依賴性,顯示了合成產(chǎn)物具有一定的抗油脂氧化能力。但是,熱失重結(jié)果分析表明,合成產(chǎn)物在420 ℃前后已經(jīng)基本分解完全,其穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于合成前的石榴籽多糖,這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致,這也充分證明了有機(jī)金屬螯合物存在著自身穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)和不足。本試驗(yàn)中,合成產(chǎn)物自身穩(wěn)定性下降的原因可能是:合成產(chǎn)物由于存在著Se=O健,在熱分解過程中,C-O鍵的電子云向Se=O健轉(zhuǎn)移,增強(qiáng)了Se=O鍵結(jié)合強(qiáng)度,同時(shí)消弱了C-O鍵合力,使亞硒酸基團(tuán)成為容易離去的基團(tuán),而亞硒酸基團(tuán)的離去引起了多糖較快的分解,從而使合成產(chǎn)物穩(wěn)定性下降。