亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌抑菌活性及機(jī)理研究

        2019-08-26 02:51:02舒慧珍唐志凌陳衛(wèi)軍陳海明胡月英陳文學(xué)
        食品工業(yè)科技 2019年12期
        關(guān)鍵詞:膜電位細(xì)胞膜檸檬

        舒慧珍,唐志凌,劉 雪,陳衛(wèi)軍,陳海明,胡月英,陳文學(xué),*

        (1.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228; 2.海南大學(xué)材料與化工學(xué)院,海南???570228)

        食品貯藏過(guò)程中一些因素如物理、化學(xué)、酶和微生物的變化等可以導(dǎo)致食物腐敗,能夠引起食物中毒和食源性疾病,嚴(yán)重危害公共健康和安全。而引起食品腐敗變質(zhì)的最重要的原因是致腐和致病性微生物的生長(zhǎng),如假單胞菌屬、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和糞腸球菌等[1]。嗜冷菌是一種食品在低溫貯藏條件下的關(guān)鍵腐敗微生物,能產(chǎn)生耐熱的、在食品加工設(shè)備和管道中以生物膜形式存在的脂肪酶或蛋白酶。在這種生存情況下,增強(qiáng)了嗜冷菌對(duì)加熱、消毒等傳統(tǒng)殺菌形式的耐受能力,從而導(dǎo)致食品的腐敗變質(zhì)[2]。熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)為假單胞菌屬嗜冷革蘭氏陰性菌,是一種廣泛存在于水和土壤中的環(huán)境污染菌,能夠在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)繁殖,是引起低溫條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)菌群,也是引起敗血癥、感染性休克和血管內(nèi)凝血等疾病的條件致病菌[3],嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。

        近年來(lái),人們常常向食品中加入一些化學(xué)防腐劑來(lái)抑制或殺死病原菌從而達(dá)到延長(zhǎng)食品貨架期的目的,但是過(guò)量和長(zhǎng)時(shí)間使用化學(xué)防腐劑會(huì)影響消費(fèi)者的健康。山梨酸、苯甲酸等抑菌性較強(qiáng)但價(jià)格低廉的化學(xué)類(lèi)食品防腐劑在食品行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用,但由于其溶解性低及安全性差等問(wèn)題,其局限性也越來(lái)越明顯[4]。天然防腐劑因抗菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣、水溶性好、增加風(fēng)味等優(yōu)點(diǎn)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[5]。目前人們正在積極努力尋找可以替代人工合成的化學(xué)防腐劑的天然防腐劑。

        檸檬烯,又稱(chēng)苧烯,學(xué)名為1-甲基-4-異丙基環(huán)己烯,常溫下為無(wú)色油狀液體,具有令人愉快的檸檬樣香氣[6-7],因其抑菌、增香、抗癌、平喘等功效在食品、醫(yī)藥、日化等行業(yè)得到廣泛利用[8]。檸檬烯廣泛存在于一些天然植物中,如作為海南黑、白胡椒主要香氣成分——D-檸檬烯的含量為18.04%和5.5%[9]。檸檬烯具有廣譜抗菌性,能夠很好的抑制一些細(xì)菌及真菌的生長(zhǎng)繁殖[10]。檸檬烯對(duì)引起肉類(lèi)腐敗的常見(jiàn)致腐菌(大腸桿菌、黑曲霉和金黃色葡萄球菌等)都有較好的抑制和殺滅效果[11]。研究發(fā)現(xiàn),檸檬烯及其乳化液和丙酮溶液對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌3種食源性病原菌都具有較強(qiáng)的抑菌作用[12-13]。

        檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌具有較好的抑制作用。較多學(xué)者研究檸檬烯對(duì)一些腐敗菌的抑菌活性時(shí)僅通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度、生長(zhǎng)曲線等指標(biāo),簡(jiǎn)要說(shuō)明了檸檬烯的抑菌效果,并未深入探究其抑菌機(jī)理。本研究通過(guò)最小抑菌濃度(MIC)和生長(zhǎng)曲線等指標(biāo)確定檸檬烯對(duì)P.fluorescens的抑菌活性,并通過(guò)掃描電鏡觀察、FDA染色實(shí)驗(yàn)、膜電位的測(cè)定、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量、ATP 含量、琥珀酸脫氫酶活性的變化等進(jìn)一步探究檸檬烯對(duì)P.fluorescens的抑菌機(jī)理,為檸檬烯作為天然抑菌劑提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        GI54DS型高壓滅菌鍋 致微儀器有限公司;SW-CJ-1FD型無(wú)菌超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;SPX-288型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;SHA-2型恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司;CR22N型落地式高速冷凍離心機(jī)、S-3000型掃描式電子顯微鏡 日本日立公司;TU1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Christ Alpha1型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Marin Christ公司;JYD-650L型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海五相儀器儀表有限公司;WGY-10型熒光分光光度計(jì) 天津港東科技發(fā)展股份有限公司;SP-Max3500FL型多功能酶標(biāo)儀 上海閃譜生物科技公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 菌株活化 將熒光假單胞菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化并置于30 ℃ 培養(yǎng)18~24 h,采用麥?zhǔn)媳葷岱╗14]調(diào)整菌液濃度為106~107CFU/mL待用。

        1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定 采用肉湯稀釋法[15]測(cè)定最小抑菌濃度。將檸檬烯用20%乙醇溶解,二倍梯度稀釋為400、200、100、50、25、12.5、6.25 mL/L抑制液備用。分別將2 mL不同濃度抑制液與18 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基混勻,使檸檬烯終濃度分別為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 mL/L。以加入等量無(wú)菌水和20%乙醇為空白和陰性對(duì)照。加入200 μL用無(wú)菌生理鹽水稀釋至106~107CFU/mL的菌懸液涂布均勻,倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,以肉眼看不見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的最小稀釋濃度為最小抑菌濃度(MIC)。

        1.2.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 通過(guò)紫外分光光度法[16]測(cè)定P.fluorescens的生長(zhǎng)曲線。用無(wú)菌生理鹽水將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的P.fluorescens稀釋至106~107CFU/mL,并按5%(v/v)的接種量接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,加入終濃度為1×MIC、2×MIC的檸檬烯,以無(wú)菌水和20%乙醇為空白和陰性對(duì)照,放置于30 ℃,180 r/min搖床中培養(yǎng),每隔1 h通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量600 nm處吸光值,通過(guò)吸光值繪制生長(zhǎng)曲線反映出其生長(zhǎng)速率。

        1.2.4 細(xì)胞形態(tài)的觀察 采用掃描電鏡法[17]觀察P.fluorescens細(xì)胞外部形態(tài)的變化。在培養(yǎng)至12 h的菌懸液中加入終濃度為1×MIC和2×MIC的檸檬烯,以無(wú)菌水和20%乙醇為空白和陰性對(duì)照組。放置于30 ℃,180 r/min搖床中培養(yǎng),分別取培養(yǎng)至4、8 h的菌懸液,以6000 r/min低溫離心10 min收集菌體。使用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.2)洗滌3次,用20%、40%、60%、80%乙醇溶液梯度脫水后用無(wú)水乙醇洗脫3次。在-20 ℃預(yù)凍2 h,冷凍干燥12 h后取樣鍍金,在掃描電鏡上放大8000倍觀察細(xì)胞形態(tài)。

        1.2.5 二乙酸熒光素染色實(shí)驗(yàn) 用二乙酸熒光素(FDA)染色實(shí)驗(yàn)[18]研究檸檬烯對(duì)P.fluorescens細(xì)胞膜通透性的影響。FDA是一種易通過(guò)細(xì)胞膜的無(wú)熒光的、不帶電荷的脂質(zhì)性分子,進(jìn)入細(xì)胞后可被酶水解為熒光素,由于其極性而留存于細(xì)胞中發(fā)出黃綠色熒光,細(xì)胞膜受到破壞,則熒光素分子流失導(dǎo)致 FDA 熒光強(qiáng)度降低[21]。因此,細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性和通透性可通過(guò)FDA熒光強(qiáng)度來(lái)反映。

        分別將培養(yǎng)12 h的菌懸液以8000 r/min低溫離心10 min棄上清并懸浮于生理鹽水中,使菌濃度約為106~107CFU/mL。分別加入1×MIC、2×MIC濃度的檸檬烯,以無(wú)菌水和20%乙醇作為空白對(duì)照和陰性對(duì)照,置于30 ℃ 180 r/min搖床培養(yǎng)。分別取6、9、12 h的菌懸液4000 r/min離心10 min收集菌體,用PBS(pH=7.2)洗滌2次后離心棄上清,加入250 μL FDA-丙酮溶液(2 mg/mL)。常溫下放置20 min后用PBS(pH=7.2)洗滌3次,8000 r/min低溫離心10 min棄上清后重懸于PBS(pH=7.2)中,用熒光分光光度計(jì)測(cè)定平均熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長(zhǎng)為297 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm。

        著眼于高素質(zhì)創(chuàng)新型技能型人才的培養(yǎng)目標(biāo),高職語(yǔ)文教學(xué)目標(biāo)應(yīng)該包含以下幾個(gè)方面:一是夯實(shí)語(yǔ)文基礎(chǔ)知識(shí)和基礎(chǔ)能力;二是提升學(xué)生審美素養(yǎng),提高學(xué)生的心理和情商指數(shù),培養(yǎng)學(xué)生高雅、純正的審美情趣;三是重視語(yǔ)文的德育、態(tài)度、價(jià)值觀的養(yǎng)成,促進(jìn)學(xué)生健全人格的養(yǎng)成;在此基礎(chǔ)上,我們提出第四種課程目標(biāo),即提升學(xué)生的創(chuàng)新理念、創(chuàng)新思維、創(chuàng)新實(shí)踐能力,進(jìn)而提高語(yǔ)言創(chuàng)新能力、思維能力、解決問(wèn)題能力為目的,以有利于學(xué)生的職業(yè)發(fā)展;通過(guò)教學(xué)目標(biāo)的重新定位,把創(chuàng)新能力培養(yǎng)作為高職語(yǔ)文教學(xué)目標(biāo)的重要構(gòu)成加以重視,并在具體的教學(xué)實(shí)踐中加以實(shí)施。

        1.2.6 膜電位的測(cè)定 膜電位的大小可反映細(xì)胞的代謝活性,為了研究檸檬烯對(duì)P.fluorescens代謝活性變化的影響,根據(jù)Zhang等[19]的羅丹明123熒光染色法并進(jìn)行適當(dāng)修改測(cè)定細(xì)菌的膜電位(MP)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌懸液中(~1×107CFU/mL)中分別加入1×MIC和2×MIC濃度的檸檬烯,以無(wú)菌水和20%乙醇為空白和陰性對(duì)照,并于30 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)3 h。離心收集菌體,再用PBS洗滌2次后并溶解。將羅丹明123加入PBS中配置成1 mg/mL母液后,加入菌液中使其終濃度為2 μg/mL,在黑暗中靜置30 min后,將樣品洗滌3次并重懸于PBS中,用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm下測(cè)定平均熒光強(qiáng)度。

        1.2.7 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液中加入終濃度為1×MIC、2×MIC檸檬烯,以無(wú)菌水和20%乙醇為空白和陰性對(duì)照,置于搖床(30 ℃,180 r/min)分別取培養(yǎng)0、3、6、9、12 h的菌懸液在8000 r/min條件下低溫離心10 min收集菌體,用PBS(pH=7.2)洗滌3次并重懸。通過(guò)超聲細(xì)胞破碎儀在冰上破碎細(xì)胞5 min,并以10000 r/min 離心10 min,棄細(xì)胞殘?jiān)?取上清保存于4 ℃。采用考馬斯亮藍(lán)法[20]用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于595 nm下測(cè)定吸光值,根據(jù)公式計(jì)算得出胞內(nèi)蛋白含量。測(cè)得的蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=0.8299X-0.0004,R2<0.9993(X表示蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL),Y表示吸光值)。

        1.2.8 ATP含量的測(cè)定 參照Sánchez等[21]的方法并稍作修改測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ATP含量。取1.2.7超聲破碎后的樣液分別用ATP測(cè)定試劑盒測(cè)量胞內(nèi)ATP含量。將反應(yīng)后的混合物轉(zhuǎn)移至96孔板中用酶標(biāo)儀測(cè)定在波長(zhǎng)為636 nm下的吸光值。

        1.2.9 琥珀酸脫氫酶(SDH)活性測(cè)定 采用SDH測(cè)定試劑盒的方法,取 100 μL 1.2.7中超聲破碎后的樣液,沖入2.6 mL 已配制好并預(yù)溫的工作液,迅速混勻并計(jì)時(shí),將可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)設(shè)定為600 nm,5 s時(shí)記錄吸光度值A(chǔ)1,65 s時(shí)記錄吸光度值A(chǔ)2,計(jì)算2次吸光度差值ΔA=(A1-A2),并運(yùn)用公式計(jì)算SDH活性:

        SDH活性(U/mg)=[(ΔA值/0.01)/反應(yīng)時(shí)間(min)]/[取樣量(mL)×待測(cè)蛋白樣本濃度(mg/mL)]

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析,使用Origin軟件制圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度(MIC)

        由表1可知,檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌有較好的抑菌效果,且抑菌能力隨著其濃度的增加而增強(qiáng),當(dāng)檸檬烯濃度為20 mL/L時(shí)細(xì)菌不能生長(zhǎng),即檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌的最小抑菌濃度為20 mL/L,且20%乙醇溶液對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響。

        表1 熒光假單胞菌生長(zhǎng)情況Table 1 The growth of P. fluorescens

        2.2 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)的影響

        如圖1所示,添加水和20%乙醇組的細(xì)菌生長(zhǎng)呈現(xiàn)S型生長(zhǎng)曲線,在2~17 h時(shí),細(xì)菌迅速增長(zhǎng)并在17 h時(shí)OD600分別達(dá)到2.42和2.43。20%乙醇組生長(zhǎng)相較于空白組略為緩慢,但最終幾乎同時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期,說(shuō)明20%乙醇對(duì)細(xì)菌影響不大。但向菌液中加入終濃度為1×MIC和2×MIC檸檬烯時(shí),菌液OD600均低于對(duì)照組。添加1×MIC和2×MIC檸檬烯組在0~12 h期間值處于較為平穩(wěn)的狀態(tài),基本上沒(méi)有變化;12~16 h OD值略有上升,之后趨于平穩(wěn)狀態(tài),最大OD值僅分別達(dá)到0.43和0.51。結(jié)果表明加入終濃度為1×MIC和2×MIC的檸檬烯能夠有效的抑制熒光假單胞菌的生長(zhǎng)。

        圖1 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of limonene on the growth of P. fluorescens

        2.3 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞形態(tài)的影響

        掃描電鏡結(jié)果如圖2所示,空白組(A1、A2)的熒光假單胞菌結(jié)構(gòu)形態(tài)較為完整,呈正常的短桿狀,形態(tài)飽滿,表面較為光滑,未出現(xiàn)細(xì)胞破損及內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象。20%乙醇組(B1、B2)的熒光假單胞菌經(jīng)4 h的處理后細(xì)胞形態(tài)較為完好,沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化,8 h處理后細(xì)胞形態(tài)受到的破壞很微小,大部分細(xì)胞仍呈正常的形態(tài)。而檸檬烯處理4 h后(C1、D1)的熒光假單胞菌的細(xì)胞菌體干癟,表面粗糙,部分細(xì)胞黏連在一起,形態(tài)發(fā)生扭曲變形,呈狹長(zhǎng)或斷裂狀,可能是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到破壞;作用8 h后(C2、D2),菌體形態(tài)受到嚴(yán)重破壞,菌體萎陷,細(xì)胞表面粗糙不平,呈現(xiàn)嚴(yán)重破裂坍塌和孔洞,從而引起細(xì)胞原生質(zhì)的外泄,而黏稠地原生質(zhì)則會(huì)引起嚴(yán)重的細(xì)胞聚集和重疊現(xiàn)象。且添加2×MIC檸檬烯相較于1×MIC的菌體細(xì)胞受到的破壞更為嚴(yán)重,存在更多的出現(xiàn)坍塌和孔洞的細(xì)胞。由此可見(jiàn),檸檬烯能夠破壞和損傷熒光假單胞菌細(xì)胞的正常形態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞,且破壞程度隨著檸檬烯濃度的增大而增大。還可能引起一些大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞以及一些胞內(nèi)物質(zhì)溢出如細(xì)原生質(zhì)的外滲[21],同時(shí)也會(huì)影響菌體細(xì)胞的正常代謝,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        圖2 熒光假單胞菌的掃描電鏡圖(8000×)Fig.2 Scanning electron microphotographs of P. fluorescens(8000×)注:A1:空白組(4 h);B1:20%乙醇組(4 h);C1:1×MIC實(shí)驗(yàn)組(4 h);D1:2×MIC實(shí)驗(yàn)組(4 h);A2:空白組(8 h);B2:20%乙醇組(8 h);C2:1×MIC實(shí)驗(yàn)組(8 h);D2:2×MIC實(shí)驗(yàn)組(8 h)。

        2.4 檸檬烯對(duì)P. fluorescens細(xì)胞膜通透性的影響

        FDA熒光強(qiáng)度低表明細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞膜完整性被破壞,引起熒光泄漏[22]。由圖3可知,處理6 h后各組的熒光強(qiáng)度均為200 AU左右,無(wú)顯著性差異(p>0.05),表明此時(shí)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)較為完整,通透性變化較小。處理9和12 h后空白對(duì)照組(水)與陰性對(duì)照組(20%乙醇)的熒光強(qiáng)度變化不顯著,而添加檸檬烯的熒光強(qiáng)度均有降低。2×MIC組的熒光強(qiáng)度降低更多,且12 h的實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度降低也更為顯著(p<0.05)。說(shuō)明添加檸檬烯9 h后能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性,且隨著檸檬烯濃度增加,作用時(shí)間延長(zhǎng),破壞程度更為明顯。

        圖3 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌FDA熒光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effects of limonene on FDA fluorescence intensity of P. fluorescens注:相同時(shí)間不同小寫(xiě)字母代表差異顯著,p<0.05;圖4同。

        2.5 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌膜電位的影響

        膜電位指的是存在于細(xì)胞膜內(nèi)外的電位差,作為質(zhì)子動(dòng)能勢(shì)的一部分能夠參與ATP的合成,是反映菌體細(xì)胞代謝和生命活力的重要指標(biāo)[23]。通過(guò)羅丹明123 的平均熒光強(qiáng)度來(lái)表示熒光假單胞菌的膜電位大小,結(jié)果如圖4所示??瞻捉M和20%乙醇組中熒光假單胞菌的平均熒光強(qiáng)度分別為68.94和56.61 AU,加入1×MIC濃度的檸檬烯后,菌液中平均熒光強(qiáng)度下降至34.41 AU,當(dāng)檸檬烯濃度達(dá)到2×MIC時(shí),熒光假單胞菌的平均熒光強(qiáng)度降至僅為7.33 AU。正常情況下細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)外的膜電位差為100~200 mV,且膜外電壓要高于膜內(nèi)電壓,如果細(xì)胞發(fā)生去極化現(xiàn)象則會(huì)引起膜電位降低,反之,細(xì)胞發(fā)生了超極化現(xiàn)象則會(huì)導(dǎo)致膜電位升高[23]。若細(xì)胞膜被破壞,由于無(wú)機(jī)離子的自由穿越,膜電位將變成零[24]。羅丹明123可通過(guò)跨膜電位進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),加入檸檬烯后細(xì)胞的膜電位遭到破壞,釋放出羅丹明123,導(dǎo)致熒光光強(qiáng)度降低。結(jié)果表明加入檸檬烯降低了熒光假單胞菌的膜電位,導(dǎo)致細(xì)胞去極化和代謝失常。

        圖4 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌膜電位的影響Fig.4 Effect of limonene on the membrane potential(MP)of P. fluorescens

        2.6 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)蛋白含量的影響

        通過(guò)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的流失可表明檸檬烯對(duì)菌體膜完整性的影響。由圖5可知,在0~12 h內(nèi),20%乙醇組菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)而增加,特別是0~6 h處于迅速增加的狀態(tài),可能是因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)菌還處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)菌快速生長(zhǎng)。而加入1×MIC和2×MIC濃度的檸檬烯則沒(méi)有引起胞內(nèi)蛋白質(zhì)的增加,兩者蛋白質(zhì)含量相差很小,說(shuō)明1×MIC已經(jīng)能夠?qū)w胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生很大的影響。測(cè)定結(jié)果表明檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌的細(xì)胞膜滲漏具有明顯的影響,且蛋白質(zhì)的滲漏現(xiàn)象隨著檸檬烯作用時(shí)間的增加越來(lái)越明顯。證明了檸檬烯通過(guò)改變菌體細(xì)胞膜的通透性,致使細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)的泄漏。

        圖5 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的影響Fig.5 Effects of limonene on intracellular protein content of P. fluorescens

        2.7 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞內(nèi)ATP含量的影響

        三磷酸腺苷(ATP)是體內(nèi)能量代謝和轉(zhuǎn)換的中心,直接為生物體的生命活動(dòng)提供能量[25]。ATP含量的變化關(guān)系到各個(gè)器官的能量代謝,并對(duì)細(xì)胞的各種生理病理過(guò)程很重要,檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌ATP含量的影響如圖6所示。空白組和對(duì)照組在0~3 h時(shí)ATP含量略有增加,而實(shí)驗(yàn)組ATP含量總體呈明顯增大趨勢(shì)。3 h時(shí),1×MIC組和2×MIC組的胞內(nèi)ATP含量達(dá)到了最大值分別為10673.91 μmol/g protein和11001.02 μmol/g protein。而這可能是由于添加了檸檬烯對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了刺激,而細(xì)胞為了保持自身的正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致ATP含量的迅速上升。有研究表明,細(xì)胞處于特殊細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化時(shí)需要高含量的ATP[26]。在3~6 h時(shí),ATP含量總體呈下降趨勢(shì),且實(shí)驗(yàn)組ATP含量急劇下降;6~12 h,空白組和乙醇組的ATP含量基本沒(méi)什么變化,而添加了抑菌物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)組ATP含量依然處于下降趨勢(shì),說(shuō)明在3~12 h,檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌ATP的合成或消耗產(chǎn)生了影響,導(dǎo)致ATP含量下降。細(xì)胞在凋亡時(shí),為了保持細(xì)胞的質(zhì)子動(dòng)勢(shì)平衡,ATP含量會(huì)急劇下降[27]。而且隨著呼吸受到抑制,ATP的含量也會(huì)急劇下降。Sánchez等[21]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌自身水解速率的增加也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP含量的下降。有研究表明抑菌劑能夠通過(guò)影響三羧酸循環(huán)和還原氫的利用而對(duì)ATP的形成產(chǎn)生一定的影響[28]。

        圖6 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌ATP含量的影響Fig.6 Effects of limonene on ATP levels of P. fluorescens

        2.8 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌琥珀酸脫氫酶活性的影響

        琥珀酸脫氫酶在微生物的細(xì)胞能量代謝中起重要作用,其活性反映了細(xì)菌細(xì)胞的能量代謝狀態(tài)[29]。琥珀酸脫氫酶是電子傳遞鏈中的關(guān)鍵酶,也是三羧酸循環(huán)中很重要的脫氫酶。琥珀酸脫氫酶受到干擾時(shí)會(huì)阻礙三羧酸循環(huán)與呼吸鏈之間的電子傳遞,從而對(duì)細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)生影響,最終影響生物體的正常生命活動(dòng)。檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌的SDH活性影響如圖7所示,空白組和乙醇組的熒光假單胞菌細(xì)胞中SDH活性略有下降,但是變化不大,1×MIC組的熒光假單胞菌細(xì)胞中的SDH活性先上升至32.58 U/mg,隨后開(kāi)始急劇下降,到12 h時(shí)下降至11.12 U/mg。但2×MIC組的熒光假單胞菌的SDH酶活則處于一種波動(dòng)狀態(tài),但總體呈下降趨勢(shì),至12 h時(shí)活性為22.69 U/mg。整體而言,實(shí)驗(yàn)組的SDH活性要低于空白組。也許是檸檬烯與琥珀酸脫氫酶酶的側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)并改變其結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化,從而降低酶活性[30]。此外,由于細(xì)菌的呼吸鏈位于細(xì)胞膜中,與抗菌劑的接觸破壞了膜結(jié)構(gòu)并破壞了酶系統(tǒng)在呼吸鏈中的功能[31]。說(shuō)明檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞有損害作用,通過(guò)抑制琥珀酸脫氫酶的活性,阻礙細(xì)胞的正常能量代謝活動(dòng),從而阻礙熒光假單胞菌的正常生長(zhǎng)。

        圖7 檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌SDH酶活力影響Fig.7 Effects of limonene on the activity of SDH enzyme from P. fluorescens

        3 結(jié)論與討論

        本研究從細(xì)胞水平上,探究檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌的抑菌機(jī)理,結(jié)果表明,檸檬烯對(duì)熒光假單胞菌具有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用,其最小抑菌濃度為20 mL/L。檸檬烯能夠使熒光假單胞菌的細(xì)胞膜完整性受到破壞,滲透性增加,菌體細(xì)胞質(zhì)外滲,導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低和相關(guān)酶的泄漏,干擾其正常的物質(zhì)及能量代謝,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

        如今,消費(fèi)者為保持健康的生活方式對(duì)天然和安全的食品產(chǎn)品越來(lái)越關(guān)注。因此,檸檬烯作為一種天然的活性物質(zhì)抑菌劑,在天然防腐劑的開(kāi)發(fā)等方面具有較好價(jià)值,也逐漸成為食品保鮮領(lǐng)域的重要組成部分。本研究已探索了檸檬烯作為天然抗菌劑對(duì)于嗜冷性腐敗微生物代表的熒光假單胞菌的抑菌機(jī)理,表明檸檬烯在食品中的應(yīng)用具有良好的潛力,同時(shí)也為研究天然單萜類(lèi)化合物對(duì)一些腐敗菌的抑菌機(jī)制等領(lǐng)域提供一定的參考。目前,對(duì)于檸檬烯抑菌機(jī)理的研究還不夠充分,未來(lái)的研究期望能夠進(jìn)一步闡明檸檬烯對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌機(jī)理,并擴(kuò)大檸檬烯在食品中的應(yīng)用。

        猜你喜歡
        膜電位細(xì)胞膜檸檬
        檸檬
        有關(guān)動(dòng)作電位的“4坐標(biāo)2比較”
        巧制檸檬片
        中老年保健(2021年3期)2021-12-03 02:32:25
        小檸檬
        參芪復(fù)方對(duì)GK大鼠骨骼肌線粒體膜電位及相關(guān)促凋亡蛋白的影響研究
        皮膚磨削術(shù)聯(lián)合表皮細(xì)胞膜片治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)療效觀察
        檸檬
        宮永寬:給生物醫(yī)用材料穿上仿細(xì)胞膜外衣
        魚(yú)藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化
        香芹酚對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的影響
        蜜臀色欲av在线播放国产日韩| 免费在线观看草逼视频| 成人久久黑人中出内射青草| 国产精品久久久久高潮| 国产精品人妻一区夜夜爱| 国产精品久久婷婷婷婷| 国产精品自拍网站在线| 亚洲av无码成人精品国产| 日本黄页网站免费观看| 日韩av在线毛片| 国产av一区麻豆精品久久| 人妻夜夜爽天天爽三区丁香花 | 国内自拍色第一页第二页| 无码国产精品一区二区免费式直播 | 久久av无码精品人妻糸列| 亚洲国产都市一区二区| 97精品人妻一区二区三区蜜桃| 亚洲色欲色欲www| 无码精品色午夜| 日本视频一区二区这里只有精品| 亚洲精品在线国产精品| 亚洲产国偷v产偷v自拍色戒| 国产人成亚洲第一网站在线播放 | 在线视频一区二区日韩国产| 国产三级精品三级在专区中文| 18禁止进入1000部高潮网站| 久久婷婷成人综合色| 亚洲综合伦理| 白白色发布在线播放国产| 国产免费精品一品二区三| 婷婷四虎东京热无码群交双飞视频 | 精品人妻无码视频中文字幕一区二区三区| 色丁香久久| 久久久99精品国产片| 无码av专区丝袜专区| 99蜜桃在线观看免费视频网站| 鲁丝一区鲁丝二区鲁丝三区| 久久亚洲中文字幕伊人久久大| 最新中文字幕av无码不卡| 人妻丰满熟妇av无码区免| 亚洲综合一|