羅澤萍,潘立衛(wèi),覃 玥

(河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西高校微生物及植物資源開發(fā)利用重點實驗室,廣西宜州 546300)

食源性疾病和食品病菌污染是當(dāng)今世界上最廣泛的衛(wèi)生問題之一,也是我國食品安全問題的重點。金黃色葡萄球菌(S.aureus)是一種常見的食源性病原菌,可以通過各種途徑和方式污染食品[1]。抑制食源性腐敗菌和致病菌的生長、延長食品的保質(zhì)期及防止食物變質(zhì)等方面具有重要意義。因此,尋找新的、安全的、綠色及高效的抑菌食品添加劑已成為世界研究領(lǐng)域的熱點課題之一。中草藥活性成分具有化學(xué)合成物無法比擬的結(jié)構(gòu)及生物活性多樣性、多靶點抑制菌體生長繁殖、資源豐富、價格低廉、毒副作用小、不易殘留及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點,是天然防腐劑研究的寶貴資源。

臭茉莉(Clerodendrumphilippinumvar.simplex)為馬鞭科大青屬植物,其味微苦、平,歸脾、肝、腎經(jīng),具有活血消腫、祛風(fēng)除濕和化痰止咳等功效[2]。目前,對臭茉莉的研究主要集中在化學(xué)成分、提取工藝及抗氧化作用等[3-7],而對抑菌作用的研究未見文獻(xiàn)報道。本實驗擬考察臭茉莉正丁醇提取物(ECP)對4種供試菌的抑菌效果,并以S.aureus為例,通過考察其細(xì)胞膜、細(xì)胞壁及形態(tài)結(jié)構(gòu)等的變化,研究ECP的抑菌活性及機理,以期為臭茉莉在食品、醫(yī)療等行業(yè)的應(yīng)用提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

臭茉莉 采摘于廣西河池市宜州區(qū)小龍村,經(jīng)河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院鄧晰朝副教授鑒定為臭茉莉(Clerodendrumphilippinumvar.simplex)莖葉,將新鮮臭茉莉莖葉于50 ℃烘箱中烘干,粉碎后備用;金黃色葡萄球(S.aureusATCC6538)、傷寒桿菌(S.entericaATCC13311)、綠膿桿菌(P.aeruginosaATCC27853)、表皮葡萄球菌(S.epidermidisATCC35983) 河池學(xué)院化學(xué)與生物工程制藥工程實驗室保藏;活性氧(ROS)檢測試劑盒 碧云天生物技術(shù);鉀離子測定試劑盒 長春匯力生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒 上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;堿性磷酸酶(AKP)試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒、蘋果酸脫氫酶(MDH) 南京建成生物工程研究所;蛋白濃度測定試劑盒 北京常萊寶科技有限公司(20171116);其他試劑均國產(chǎn)為分析純。

JA2003B電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;HVE-50全自動滅菌鍋 華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司;ZHJH-C1209B超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造有限公司;SPX-150生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;SU80-40掃描電鏡 日立高新技術(shù)公司;UV-8000紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;Accuri? C6 Plus流式細(xì)胞儀 美國BD;xMark酶標(biāo)儀 美國伯樂BIO-RAD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臭茉莉提取物的制備 稱600 g臭茉莉粉末,10倍量的80%乙醇超聲提取3次,每次1 h,合并濾液,提取液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,減壓濃縮蒸干溶劑,得到石油醚部位浸膏4.1 g、乙酸乙酯部位浸膏4.6 g、正丁醇部位浸膏26.5 g、水部位浸膏59.9 g。預(yù)實驗結(jié)果顯示正丁醇部位抑菌效果最好,因此,我們深入研究正丁醇部位的抑菌效果及機制。

1.2.2 藥敏試驗測定 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基滅菌后倒入無菌培養(yǎng)皿中,待凝固后加入0.1 mL(109cfu/L)各供試菌菌懸液,無菌涂布環(huán)涂布均勻,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取專用藥敏紙片(直徑6.35 mm,吸水量為20 μL)和對照紙片均勻間隔貼于上述含菌平板表面,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出,用游標(biāo)卡尺測定各藥敏紙片抑菌圈直徑,平行操作3次,計算平均抑菌圈直徑(DIZ)[8]。以慶大霉素(加菌)及無菌水(不加菌)作為對照。

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測定 配置濃度分別為10.00、5.0、2.50、1.25、0.50、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的ECP溶液,各取10 μL加入到含有100 μL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基與100 μL刃天青指示劑貯備液[9](由5 mL濃度為107cfu/mL的菌液和7.5 mL的刃天青指示劑配置,無菌孔以無菌水代替菌液)的96孔板中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,無菌生長孔為藍(lán)色,有細(xì)菌生長的孔會逐漸由藍(lán)色變粉色。MIC確定后,吸取所有未變色濃度的樣品5 μL,加入到100 μL培養(yǎng)基與刃天青指示劑貯備液中,培養(yǎng)24 h,仍舊不見顏色變化的孔,即為MBC。并設(shè)立慶大霉素組(加菌)及無菌水組(不加菌)作為對照。

1.2.4 生長曲線測定 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別加入對數(shù)生長期的S.aureus與ECP,使藥物終濃度為1×MIC、2×MIC及3×MIC,并調(diào)整細(xì)菌的濃度為107cfu/mL,另設(shè)無菌水作為空白對照,37 ℃ 130 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)。每隔2 h紫外分光光度計測定600 nm波長下各組培養(yǎng)液吸光度值[10],取3次重復(fù)實驗的平均值。

1.2.5 ECP對S.aureus細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響

1.2.5.1 細(xì)胞膜通透性測定 菌體處理方法同1.2.4。取連續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9 h各組培養(yǎng)液2 mL,離心10 min(4000 r/min)并去除沉淀后,用紫外分光光度計測定各組培養(yǎng)液上清液DNA、RNA等大分子物質(zhì)含量。取連續(xù)培養(yǎng)2、4、6、8、10、12 h各組培養(yǎng)液2 mL,離心10 min(4000 r/min)并去除沉淀后,試劑盒法測定培養(yǎng)液上清液K+含量[11-12]。取3次重復(fù)實驗的平均值。

1.2.5.2 細(xì)胞壁通透性測定 菌體處理方法同1.2.4。取連續(xù)培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h各組培養(yǎng)液1.5 mL,離心10 min(4000 r/min)并去除沉淀后,試劑盒法測定各組培養(yǎng)液上清液AKP含量[13]。取3次重復(fù)實驗的平均值。

1.2.5.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的測定 菌體處理方法同1.2.4。取連續(xù)培養(yǎng)20 h的各組培養(yǎng)液,離心10 min(4000 r/min)并去除上清液,取沉淀用PBS稀釋至在紫外分光光度計下吸光度為0.6(600 nm),取相同體積的各菌懸液離心去除上清液,將沉淀懸浮于樣品緩沖液及無菌水的混合液中(體積比為1∶4)混勻,在100 ℃水浴中煮沸10 min,離心10 min(4000 r/min)去除沉淀,取上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳[14]。

1.2.6 TCA循環(huán)中SDH、MDH活性的測定 菌體處理方法同1.2.4。取各組培養(yǎng)液2 mL,離心10 min(4000 r/min)并去除上清液,用0.1 mol/L的Tris-HCl(pH=7.4)緩沖液洗滌沉淀2～3次后,加入等體積的溶菌酶溶液,37 ℃水浴25 min后冰浴,再加入Tris-SDS(pH=9.0)緩沖液1 mL,低溫離心15 min(10000 r/min)并去除沉淀[15]。按試劑盒說明書操作方法測定各組培養(yǎng)液上清液在2、4、6、8、10、12 h的SDH、MDH活性。

1.2.7 胞內(nèi)ROS水平的測定 菌體處理方法同1.2.4。取連續(xù)培養(yǎng)12 h各組培養(yǎng)液,離心10 min(4000 r/min)并去除上清液,用PBS緩沖液洗滌沉淀2～3次后,再用PBS緩沖液稀釋成106cfu/mL的菌懸液,按試劑盒說明書操作方法用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測各試驗組熒光強度[16]。

1.2.8 細(xì)胞凋亡的測定 菌體處理方法同1.2.4。取連續(xù)培養(yǎng)20 h各組培養(yǎng)液離心10 min(4000 r/min)并去除上清液,用PBS緩沖液洗滌沉淀2～3次后,用連接素V(Annexin V)結(jié)合緩沖液稀釋成1×106cfu/mL的菌懸液。按照試劑盒說明書操作方法用FCM測定各試驗組熒光強度[16]。

1.2.9 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)測定 在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中分別加入對數(shù)生長期的S.aureus與一定質(zhì)量的ECP,使ECP終濃度為3×MIC,并調(diào)整細(xì)菌的濃度為1×109cfu/m,以無菌水作為空白對照組,于37 ℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后,按電鏡制樣技術(shù)準(zhǔn)備待觀察樣本,通過掃描電鏡(SEM)觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)用“X±S”表示,組間兩兩比較采用t檢驗,以p<0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 ECP抑菌效果DIZ、MIC及MBC測定

由表1可見,ECP對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球、傷寒桿菌及綠膿桿菌均有不同程度的抑菌作用,DIZ分別為9.17、21.35、13.81及9.98 mm,MIC和MBC分別為2.50、5.00;0.50、0.50;1.25、1.25及2.50、2.50 mg/mL。表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球?qū)儆诟锾m氏陽性菌,傷寒桿菌、綠膿桿菌屬于革蘭氏陰性菌,表明ECP對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有抑制作用,其中對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強,但是抑菌效果比慶大霉素弱,可能是因為慶大霉素純度比較高,因此抑菌效果較好。因此,我們深入研究ECP對金黃色葡萄球菌的抑菌機理。

表1 ECP的DIZ、MIC及MBC測定結(jié)果Table 1 Results of DIZ,MIC and MBC of ECP

2.2 生長曲線的測定結(jié)果

細(xì)菌的生長曲線可以體現(xiàn)出菌體的生長規(guī)律、藥物對細(xì)菌生長增殖周期的抑制情況、藥物對細(xì)菌產(chǎn)生的作用機理及藥效隨時間的變化規(guī)律等[18-19]。由圖1可見S.aureus在經(jīng)過4 h延滯期后進(jìn)入快速生長的對數(shù)期,而ECP處理組S.aureus未出現(xiàn)快速生長對數(shù)期,說明ECP具有縮短細(xì)菌的分裂速度,延緩其對數(shù)期,從而抑制菌體數(shù)量的增加,并且濃度越大,抑制效果越強。結(jié)果表明ECP的抑菌機理可能與影響菌體生長增殖周期有關(guān)。

圖1 金黃色葡萄球菌生長曲線圖Fig.1 Growth curves of S.aureus

2.3 ECP對S. aureus細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的影響

2.3.1 細(xì)胞膜完整性 細(xì)菌是通過細(xì)胞膜的通透性吸收周圍的營養(yǎng)物質(zhì),同時把細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的廢棄物排出細(xì)胞外[20-21]。K+是維持生命的重要礦物質(zhì)之一,能維持細(xì)胞內(nèi)外液的滲透壓平衡及調(diào)節(jié)細(xì)胞的新陳代謝[22]。當(dāng)細(xì)胞膜完整無損的時候K+不會出現(xiàn)外泄,但當(dāng)細(xì)胞膜通透性增大時K+將出現(xiàn)大量外泄[23]。由圖2、圖3可見,與對照組相比,ECP處理組S.aureusDNA、RNA大分子物質(zhì)、K+外泄逐漸增加,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,在8 h時1×MIC、2×MIC、3×MIC組培養(yǎng)液S.aureus的DNA、RNA大分子物質(zhì)外泄依次增加了0.74倍、1.88倍、2.39倍,K+外泄依次增加了0.68倍、2.32倍、3.49倍,且差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明ECP對S.aureus的抑菌機理可能與破壞菌體細(xì)胞膜,使細(xì)胞膜通透性增大有關(guān)。

圖2 DNA、RNA等大分子物質(zhì)外泄曲線圖Fig.2 Leakage curves of large molecules of DNA and RNA注:*代表相同培養(yǎng)時間下,與對照組相比差異顯著,p<0.05;圖3～圖4、圖6～圖7同。

圖3 K+外泄曲線圖Fig.3 Leakage curves of K+

2.3.2 細(xì)胞壁完整性 細(xì)胞壁是維持細(xì)菌細(xì)胞外形完整的堅韌結(jié)構(gòu),它既能適應(yīng)多樣的環(huán)境變化,又能保護(hù)細(xì)菌的滲透作用[22]。AKP存在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間,當(dāng)細(xì)胞壁通透性增大或遭到破壞時培養(yǎng)液會檢測到大量的AKP。由圖4可以明顯看出ECP處理過的菌體上清液中AKP的含量跟對照組比有明顯增加,并隨著濃度的增加而增大。12 h時1×MIC、2×MIC、3×MIC組與空白組相比分別增加了0.44倍、0.81倍、2.30倍,且差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明ECP可能通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁完整性和通透性而起到抑菌作用。

圖4 AKP外泄曲線圖Fig.4 Leakage curves of AKP

2.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性 蛋白質(zhì)具有維持機體新陳代謝及各類物質(zhì)在體內(nèi)的輸送等功能,是生命活動的主要承擔(dān)者。如果藥物使菌體蛋白質(zhì)特定的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞,其生物功能將喪失,藥物將起到抑菌作用[21]。由圖5可知,與對照組相比,ECP作用后,S.aureus可溶性蛋白質(zhì)含量明顯降低,但是種類并未發(fā)生改變,1×MIC、2×MIC、3×MIC組與對照組相比分別降低了18.39%、31.01%、38.07%。結(jié)果表明ECP的抑菌機理可能阻礙菌體某些蛋白的合成,從而起到抑制細(xì)菌生長的作用。

圖5 可溶性蛋白含量的變化圖Fig.5 Changes of soluble protein content注:泳道1:3×MIC;泳道2:2×MIC;泳道3:1×MIC;泳道4:對照組;泳道5:Marker。

2.4 ECP對TCA循環(huán)中SDH和MDH活性的影響

TCA循環(huán)是有氧呼吸中重要的生物化學(xué)變化過程,是物質(zhì)代謝中心[24]。SDH和MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶[25-26]。由圖6和圖7可知,ECP能降低菌體SDH、MDH活性;菌體在連續(xù)培養(yǎng)12 h時,1×MIC、2×MIC、3×MIC組與對照組相比SDH分別下降了61.73%、66.67%及80.25%;MDH下降了59.09%、69.06%及83.70%,且差異顯著(p<0.05)。結(jié)果表明ECP的抑菌作用機理可能是通過破壞TCA循環(huán),導(dǎo)致菌體新陳代謝減慢而起到抑制其繁殖和生長作用。

圖6 SDH活性變化曲線圖Fig.6 SDH activity change curves

圖7 MDH活性變化曲線圖Fig.7 MDH activity change curves

2.5 胞內(nèi)活性氧水平的測定結(jié)果

圖8 對照組ROS水平Fig.8 ROS levels of control group

圖9 1×MIC組ROS水平Fig.9 ROS level of 1×MIC group

圖10 2×MIC組ROS水平Fig.10 ROS level of 2×MIC groups

圖11 3×MIC組ROS水平Fig.11 ROS level of 3×MIC groups

2.6 細(xì)胞凋亡測定結(jié)果

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在環(huán)境條件改變時為了維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而通過基因調(diào)控使一些老化的細(xì)胞自動結(jié)束生命的過程。磷脂酰絲氨酸(PS)在細(xì)胞凋亡早期會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。Annexin V是一種能與PS特異性結(jié)合的磷脂蛋白。用帶有綠色熒光的熒光探針異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Annexin V,即Annexin V-FITC,就可以用流式細(xì)胞儀非常簡單而直接地檢測到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一種能通過凋亡中晚期破損細(xì)胞膜而對細(xì)胞核染色的染色劑,其不能通過活細(xì)胞膜。因此FITC標(biāo)記的Annexin V結(jié)合PI雙染色就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞區(qū)分開來[29]。由圖12～圖15 FCM散點圖可見,菌體經(jīng)ECP處理后,Annexin V-FITC染色陽性并且PI染色陰性的細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞增加(圖的右下象限Q1-LR),Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,也有所增加(圖的右上象限Q1-UR)。圖中Annexin V-FITC染色陰性PI染色陽性(Annexin V-/PI+)所在象限(圖的左上象限Q1-UL)出現(xiàn)的細(xì)胞點是許可范圍內(nèi)的檢測誤差。細(xì)胞凋亡率=Q1-UR+Q1-LR,1×MIC、2×MIC及3×MIC組細(xì)胞凋亡率對空白組對比分別增加了9.5%、16.3%、35.3%。結(jié)果表明ECP的抑菌作用可能與促使S.aureus發(fā)生細(xì)胞凋亡及影響菌體一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控具有一定關(guān)系。

圖12 對照組細(xì)胞凋亡圖Fig.12 Apoptosis of control group

圖13 1×MIC細(xì)胞凋亡圖Fig.13 Apoptosis of 1×MIC group

圖14 2×MIC細(xì)胞凋亡圖Fig.14 Apoptosis of 2×MIC group

圖15 3×MIC細(xì)胞凋亡圖Fig.15 Apoptosis of 3×MIC group

2.7 形態(tài)構(gòu)造變化測定結(jié)果

由圖16可見對照組S.aureus掃描電鏡下外觀飽滿、形態(tài)規(guī)則、表面光滑。圖17可見ECP作用24 h后掃描電子顯微鏡(SEM)下菌體明顯比對照組少,并且形態(tài)結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重,出現(xiàn)皺縮、干癟、畸形,甚至菌體自溶。表明ECP具有破壞菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)的作用,可能與破壞菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等作用有關(guān)。

圖16 對照組掃描電鏡圖(5000×)Fig.16 SEM of the control group(5000×)

圖17 3×MIC組掃描電鏡圖(5000×)Fig.17 SEM of 3×MIC group(5000×)

3 結(jié)論

抑菌試驗結(jié)果顯示ECP對革蘭氏陽性菌及陰性菌均具有不同程度的抑菌作用,對S.epidermidis(G+)、S.aureus(G+)、S.enterica(G-)、P.aeruginosa(G-)的DIZ分別為9.17、21.35、13.81及9.98 mm,MIC和MBC分別為2.50、5.00,0.50、0.50,1.25、1.25及2.50、2.50 mg/mL,其中對S.aureus的抑制作用最強。S.aureus在ECP作用后,大量DNA、RNA等大分子物質(zhì)、K+及AKP外泄;胞內(nèi)活性氧水平失衡;細(xì)胞凋亡率明顯增加;SDH活性、MDH活性均下降;蛋白質(zhì)的合成受到抑制;SEM觀察到菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重。結(jié)果表明ECP對S.aureus的抑菌靶點可能為細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、三羧酸(TCA)循環(huán)關(guān)鍵酶、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)等。綜上所述,臭茉莉具有抑菌金黃色葡萄球菌的作用,在多個水平共同作用下發(fā)揮抑菌作用，具有控制多重耐藥性細(xì)菌及應(yīng)用于食品防腐的潛力。其抑菌單體化合物的進(jìn)一步深入研發(fā)將豐富抗菌藥篩選庫,對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾有望得到有前景的抗菌新藥物。