王晗，朱華平*，李文釗，阮美娟

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300457) 2(天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心，天津，300457) 3(天津科技大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津，300457)

桑葚(mulberry)為?？坡淙~喬木桑樹(shù)的聚花果，又名桑果、桑棗[1]。桑葚很早就被當(dāng)作水果和中藥材使用[2]，國(guó)家已將其列入藥食同源物品[3]。桑葚不僅富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如有機(jī)酸、維生素和人體必需氨基酸等[4]，還含有花青素和酚類(lèi)等功效成分[5]。研究表明桑葚對(duì)自由基具有明顯的清除作用[6-7]，還具有抗癌[8]、降血糖[9]、減少脂肪[10]等多種生理功能。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，桑葚具有滋陰、明目、治療失眠和神經(jīng)衰弱、抗疲勞、防治便秘等功效[11]。桑葚提取物是以成熟的桑葚果實(shí)或者其加工余料為原料經(jīng)提取得到的紫黑色粉末，其含有大量的花青素。

花青素屬于黃酮類(lèi)化合物，是自然界廣泛存在的一類(lèi)水溶性天然色素，廣泛存在于藍(lán)紫色果蔬中[12]。自然界中存在于植物中的花青素主要有6種：矢車(chē)菊素、飛燕草素、牽牛花素、天竺葵素、芍藥素和錦葵素[13]，其中桑葚中主要為矢車(chē)菊素類(lèi)花青素[14-15]。目前，主要使用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)花青素中的各組分進(jìn)行分離鑒定，XIANG等[16]通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)桑葚中花青素進(jìn)行分離與鑒定，發(fā)現(xiàn)桑葚中的花青素主要有矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷等。且已有研究表明，花青素具有抗氧化、緩解視覺(jué)疲勞、護(hù)肝、抗腫瘤和保護(hù)神經(jīng)等作用[17-22]。

本研究使用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)桑葚提取物中的花青素進(jìn)行定性分析，并以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定花青素各組分的含量。同時(shí)測(cè)定桑葚提取物的DPPH、ABTS+、羥基自由基清除能力和還原力，為桑葚的開(kāi)發(fā)利用提供一定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚提取物，尖峰天然產(chǎn)物有限公司；矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，USP(美國(guó)藥典)；2,2’-聯(lián)氨-二(3-乙基苯并噻唑- 6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate，ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈、甲酸(色譜純)；水，超純水；其他試劑，分析純。

Ultimate 3000高效液相系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；amaZon SL離子阱質(zhì)譜儀，美國(guó)Bruker公司；A20高效液相系統(tǒng)，日本島津公司；EX125DZH電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；Milli-RO Plus超純水儀，美國(guó)Millipore公司；Thermo-C18固相萃取小柱，美國(guó)Thermo公司；3020-679酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚提取物中花青素的組成及含量分析

1.2.1.1 桑葚提取物的純化

精密稱(chēng)取10 mg桑葚提取物(精確至0.01 mg)，置于10 mL容量瓶中，用2 %鹽酸-甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的桑葚提取物溶液。

Thermo-C18固相萃取小柱先分別用5 mL甲醇溶液和5 mL水溶液清洗活化，然后加入1 mL樣品溶液，抽真空至液體流盡，再用5 mL甲醇溶液洗脫，收集甲醇洗脫液。將收集的甲醇洗脫液進(jìn)行氮吹至甲醇完全吹干，用2%鹽酸-甲醇溶液復(fù)溶至1 mL，以備液質(zhì)測(cè)定。

1.2.1.2 液相色譜及質(zhì)譜條件

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，高效液相色譜測(cè)定條件為Ultimate 3000高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A 3%甲酸水溶液；流動(dòng)相B 3%甲酸乙腈；梯度洗脫程序：0～35 min，7%～25% B；35～45 min，25%～65% B；45～46 min，65%～100% B；46～50 min，100% B；50～51 min，100%～7% B；51～60 min，7% B；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)530 nm。

質(zhì)譜條件：正離子模式，全自動(dòng)二級(jí)質(zhì)譜掃描，掃描范圍m/z 0～1 000；霧化器壓力30 Psi；干燥氣(N2)流速8 L/min；溫度230 ℃；毛細(xì)管電壓3 500 V。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及線性關(guān)系的考察

精密稱(chēng)取10 mg矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg)，置于10 mL容量瓶中，用2%鹽酸-甲醇溶解并定容，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，避光保存。

1.2.2 桑葚提取物的體外抗氧化活性

1.2.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

稱(chēng)取0.198 4 g DPPH用無(wú)水甲醇溶解并定容至50 mL，配制成0.1 mmol/L DPPH儲(chǔ)備質(zhì)量濃度液。桑葚提取物用無(wú)水甲醇分別配制成質(zhì)量濃度10、20、30、40、50 μg/mL的桑葚提取物溶液，準(zhǔn)確吸取1 mL不同濃度的桑葚提取物溶液加入到3 mL 0.1 mmol/L DPPH儲(chǔ)備液中，室溫避光30 min。以去離子水為參比溶液，以Vc為對(duì)照，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，在517 nm下測(cè)定吸光度，根據(jù)公式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率，并計(jì)算IC50。IC50越小，清除能力越強(qiáng)[23]。

(1)

式中：A0，空白對(duì)照的吸光度；Ai，加入樣品后的吸光度；Aj，樣品本身的吸光度。

1.2.2.2 ABTS+自由基清除率的測(cè)定

配制ABTS+自由基儲(chǔ)備液：將10 mL 7 mmol/L ABTS+溶液和440 μL 140 mmol/L過(guò)硫酸鉀混合，在室溫、避光條件下放置12～16 h，作為ABTS+儲(chǔ)備液。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋儲(chǔ)備液使其在734 nm處的吸光值為(0.70±0.02)。桑葚提取物用無(wú)水甲醇分別配制成質(zhì)量濃度10、20、30、40、50 μg/mL的桑葚提取物溶液。

準(zhǔn)確吸取1 mL不同濃度的桑葚提取物溶液加入到4 mL ABTS+溶液中，在30 ℃水浴中反應(yīng)6 min。以去離子水為參比溶液，以Vc為對(duì)照，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，在734 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(2)計(jì)算ABTS+清除率，并計(jì)算IC50[24]。

(2)

式中：A0，空白對(duì)照的吸光值；Ai，加入樣品后的吸光值；Aj，樣品本身的吸光值。

1.2.2.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

桑葚提取物用無(wú)水甲醇配制成質(zhì)量濃度0.2、0.5、1.0、2.0及4.0 mg/mL的桑葚提取物溶液。準(zhǔn)確吸取不同濃度的桑葚提取物溶液各1 mL，依次加入1.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分搖勻，在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min。以去離子水為參比溶液，以Vc為對(duì)照，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，在510 nm測(cè)定吸光值，根據(jù)公式(3)計(jì)算羥基自由基清除率，并計(jì)算IC50[25]。

(3)

式中：A0，空白對(duì)照的吸光值；Ai，加入樣品后的吸光值；Aj，樣品本身的吸光值。

1.2.2.4 還原力的測(cè)定

桑葚提取物用無(wú)水甲醇配制成50、100、150、200及250 μg/mL的桑葚提取物溶液。吸取不同濃度的桑葚提取物溶液各1 mL，依次加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)2.5 mL和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，在50℃水浴中反應(yīng)30 min后，快速冷卻，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，充分混勻，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，充分搖勻，反應(yīng)10 min。以去離子水為參比，以Vc為對(duì)照，在700 nm下測(cè)定吸光度值。還原力的大小用吸光值來(lái)表示，吸光值越大，還原力越強(qiáng)[26]。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑葚提取物中花青素的組成及含量分析

2.1.1 桑葚提取物中花青素的組成分析

桑葚提取物的液相色譜圖見(jiàn)圖1，同時(shí)結(jié)合質(zhì)譜分析各物質(zhì)的色譜保留時(shí)間、分子離子峰和碎片離子峰，鑒定出桑葚提取物中共有3種花青素，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 桑葚提取物的液相色譜圖

Fig.1 HPLC chromatogram of mulberry extract

表1 桑葚提取物花青素分析

Table 1 Anthocyanin analysis of mulberry extract

峰號(hào)保留時(shí)間/minMSMS/MS對(duì)應(yīng)化合物113.5449287矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷214.8595287矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷322.4287-矢車(chē)菊素

在桑葚的花青素鑒定中，據(jù)文獻(xiàn)[27]報(bào)道，花青素大多數(shù)為矢車(chē)菊素(m/z287)。峰1的一級(jí)質(zhì)譜離子峰m/z449，二級(jí)質(zhì)譜離子峰m/z287，據(jù)此可判斷其為矢車(chē)菊類(lèi)花青素。離子峰m/z449與碎片離子峰m/z287相差162，表明丟失1個(gè)葡萄糖苷，且峰1和矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，均在13.5 min時(shí)出峰，因此可判斷峰1為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷。

由峰2的一級(jí)質(zhì)譜離子峰m/z595，二級(jí)質(zhì)譜離子峰m/z287，可判斷其為矢車(chē)菊類(lèi)花青素。離子峰m/z595與碎片離子峰m/z287相差308，表明是與蕓香糖脫水縮合(縮合后質(zhì)量數(shù)308)而形成，故可初步判斷其為矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[28-29]。

由峰3的一級(jí)質(zhì)譜離子峰m/z287，可推斷其為矢車(chē)菊素單體。

2.1.2 桑葚提取物中花青素的含量分析

2.1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

分別配制質(zhì)量濃度為2、5、10、25、50、100 μg/mL的矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.1.2中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。峰面積與濃度具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=58 286x+67 727，R2=0.999 5。

2.1.2.2 精密度試驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為100 μg/mL的矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品按照1.2.1.2中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得色譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.57%，表明在該色譜條件下精密度良好。

2.1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取桑葚提取物6份，按照1.2.1方法處理并進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得桑葚提取物中矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的RSD為1.77%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.1.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

在已知含量的桑葚提取物溶液中分別加入矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(5、10、25 μg/mL)，連續(xù)進(jìn)樣3次，每次20 μL。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的平均回收率為99.20%，RSD為1.39%，表明該方法具有較高的加樣回收率。

2.1.2.5 桑葚提取物中花青素的含量測(cè)定

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程計(jì)算得出3種花青素組分的含量，以平均值±SD表示，花青素各組分的含量如表2。

表2 桑葚提取物中花青素各組分的含量

經(jīng)計(jì)算，桑葚提取物中花青素的總含量為314.30 μg/mg。從表2中可以看出，在桑葚提取物中，矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是(177.18±3.13) μg/mg，占總含量的56.37%；矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(106.59±2.06) μg/mg，占總含量的33.91%；矢車(chē)菊素單體的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，為(30.53±0.30) μg/mg，占總含量的9.71%。

2.2 桑葚提取物的體外抗氧化能力分析

2.2.1 DPPH自由基清除能力

桑葚提取物和Vc的DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。桑葚提取物的DPPH自由基清除率隨桑葚提取物濃度加大而增大，從28.72%增加到了90.07%。在同一濃度下，桑葚提取物的DPPH自由基清除能力低于Vc，當(dāng)Vc濃度為20 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率已達(dá)到95%以上，之后隨濃度的增加趨于平穩(wěn)。經(jīng)計(jì)算，桑葚提取物和Vc的DPPH自由基清除率的IC50分別為22.33 μg/mL和7.35 μg/mL。根據(jù)IC50可知桑葚提取物具有良好的DPPH清除能力，但相對(duì)于Vc較弱。

圖2 桑葚提取物和Vc的DPPH自由基清除能力

Fig.2 DPPH free radical scavenging ability of mulberry extract and Vc

2.2.2 ABTS+自由基清除能力

桑葚提取物和Vc的ABTS+自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果如圖3所示。在相同的質(zhì)量濃度下，桑葚提取物ABTS+自由基清除能力強(qiáng)于Vc，且兩者增長(zhǎng)趨勢(shì)類(lèi)似。當(dāng)兩者質(zhì)量濃度均為30 μg/mL時(shí)，桑葚提取物和Vc的ABTS+清除率都達(dá)到90%以上，之后隨濃度的增加趨于平穩(wěn)，接近100%。經(jīng)計(jì)算，桑葚提取物和Vc的ABTS+自由基清除率的IC50分別為12.90和15.55 μg/mL。根據(jù)IC50可知，桑葚提取物的ABTS+自由基清除能力強(qiáng)于Vc。

圖3 桑葚提取物和Vc的ABTS+自由基清除能力

Fig.3 ABTS+ free radical scavenging ability of mulberry extract and Vc

2.2.3 羥基自由基清除能力

羥基自由基(·OH)是活性氧類(lèi)物質(zhì)中化學(xué)性質(zhì)最活潑的一種自由基，其在自由基病理學(xué)上具有高度損傷性，幾乎在每一個(gè)活細(xì)胞內(nèi)都能發(fā)生，是一種危害程度最大的自由基[30]。桑葚提取物和Vc的羥基自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖4。在試驗(yàn)濃度的測(cè)定范圍內(nèi)，桑葚提取物的羥基自由基清除率隨濃度的增加而增加，清除率從18.46%增加到93.13%。Vc在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)到98%，后隨濃度的繼續(xù)增大接近100%。經(jīng)計(jì)算，桑葚提取物和Vc的羥基自由基清除率的IC50分別為1.74和0.48 mg/mL。根據(jù)IC50可知，桑葚提取物有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力，但是相對(duì)于Vc來(lái)說(shuō)較弱。

圖4 桑葚提取物和Vc的羥基自由基清除率

Fig.4 Hydroxyl free radical scavenging ability of mulberry extract and Vc

2.2.4 還原力

常用還原鐵氰化鉀的能力來(lái)測(cè)定還原力的大小，抗氧化劑可以將Fe3+還原成Fe2+，測(cè)定700 nm處的吸光度可以反映已被還原的Fe2+數(shù)量，從而表示為還原力的大小[31]。桑葚提取物和Vc的還原力如圖5所示。桑葚提取物和Vc的還原能力都隨濃度增大而增大。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，經(jīng)桑葚提取物還原的Fe2+的吸光度從0.043增加到0.744，而Vc對(duì)照從0.043增加到1.162，且在相同濃度下，桑葚提取物的還原力低于Vc。

圖5 桑葚提取物和Vc的還原力

Fig.5 The reducing power of mulberry extract and Vc

3 結(jié)論

本文通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用法鑒定出桑葚提取物中含有3種花青素，分別為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-蕓香糖苷和矢車(chē)菊素。以矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)品，得到桑葚提取物中總花青素含量為318.30 μg/mg，其中，矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的含量為179.52 μg/mg，占總含量的56.40%。體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明，桑葚提取物的DPPH、ABTS+和羥基自由基清除能力的IC50分別為22.33 μg/mL、12.90 μg/mL和1.74 mg/mL，在桑葚提取物溶液濃度為250 μg/mL時(shí)還原力達(dá)到0.744。本文為桑葚提取物的開(kāi)發(fā)利用提供一定理論與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。