趙永強(qiáng)，王安鳳，陳勝軍*，楊賢慶，李來(lái)好，吳燕燕，楊少玲

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州，510300) 2(江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港，222005) 3(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

合浦珠母貝(Pinctadafucata)是我國(guó)海水珍珠培育的主要品種，占海水珍珠培育總產(chǎn)量的90%以上[1]。作為采珠后副產(chǎn)物，每年有大量合浦珠母貝肉未得到充分利用。合浦珠母貝肉富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及活性成分，具有重要的食用和藥用價(jià)值，研究表明貝肉中糖胺聚糖具有免疫調(diào)節(jié)與抗腫瘤等多種功能活性[2-3]。以合浦珠母貝肉為原料，通過(guò)酶解制備貝肉水解液，水解液中含有豐富的游離氨基酸、多肽和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，但是存在腥味重，香氣不協(xié)調(diào)等缺點(diǎn)，需要進(jìn)一步優(yōu)化酶解液的風(fēng)味[4]。

米曲霉具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分泌能力和食品安全性，其分泌的蛋白酶可將蛋白質(zhì)水解，增強(qiáng)發(fā)酵液的風(fēng)味，并可加快發(fā)酵進(jìn)程[5]。何炘[6]和夏克勝[7]分別利用米曲霉發(fā)酵來(lái)改良貽貝蒸煮液和馬氏珠母貝肉呈味基料的風(fēng)味。魯氏酵母是一種增香酵母，在發(fā)酵期間可產(chǎn)生醇、呋喃等多種風(fēng)味物質(zhì)[8-9]。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵來(lái)改良水產(chǎn)品風(fēng)味的研究已多見(jiàn)報(bào)道[10-13]。相關(guān)研究表明，復(fù)合菌種發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶系更加復(fù)雜，可顯著改良水產(chǎn)品風(fēng)味[14]。因此本文采用米曲霉和魯氏酵母菌協(xié)同發(fā)酵，以發(fā)酵液風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量為考察指標(biāo)，優(yōu)化合浦珠母貝肉酶解液的發(fā)酵工藝，為發(fā)酵型海鮮調(diào)味料的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

合浦珠母貝肉酶解液，由實(shí)驗(yàn)室前期酶解試驗(yàn)所得；大豆粉、大麥粉，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻?；風(fēng)味蛋白酶(≥120 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(≥120 U/mg)，統(tǒng)一購(gòu)于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司；魯氏酵母菌、米曲霉(滬釀3.042孢子粉)，購(gòu)于沂源康源生物科技有限公司；Na2HPO4、NaH2PO4、HCHO，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠，分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-SG46-280S型滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；Akku-drive型電位滴定儀，德國(guó)赫施曼公司；DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱，上海恒科儀器有限公司；Delta320型精密pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；3K30型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；SLI-700型恒溫培養(yǎng)，上海愛(ài)朗儀器有限公司；GB204型電子天平，瑞士METTLER公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

取適量合浦珠母貝肉酶解液，經(jīng)高溫高壓滅菌后冷卻至室溫貯藏待用，菌種經(jīng)活化與擴(kuò)大培養(yǎng)后接種至酶解液中進(jìn)行發(fā)酵，隨后取發(fā)酵液進(jìn)行風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量檢測(cè)。

1.3.2 菌種活化

將面粉和大豆粉按1∶3的質(zhì)量比加適量清水混勻后，放高溫蒸汽滅菌鍋里，121 ℃滅菌15 min，冷卻至室溫后接入0.1%(以混合后物料總量計(jì))的干菌種，在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)一段時(shí)間，取樣、粉碎，測(cè)活菌落數(shù)，備用。

1.3.3 曲種中活菌數(shù)的測(cè)定

菌落總數(shù)的測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]。

1.3.4 曲種的制備

將活化好的菌種添加到面粉與大豆粉混合制備的培養(yǎng)基里，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。通過(guò)稀釋平板計(jì)數(shù)法，使曲種的菌體濃度保持在(0～1)×108CFU/g，備用。

1.3.5 合浦珠母貝肉酶解液的發(fā)酵

將經(jīng)水解后的合浦珠母貝肉酶解液調(diào)整pH至7.0，隨后添加適量NaCl及擴(kuò)大培養(yǎng)的曲種，曲種菌體濃度為(1～5)×108CFU/g。采用兩段式發(fā)酵方式，先添加米曲霉進(jìn)行有氧發(fā)酵，隨后添加魯氏酵母菌進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵，2種菌發(fā)酵時(shí)間各占總發(fā)酵時(shí)間的1/2。

1.3.6 發(fā)酵液感官風(fēng)味評(píng)定

由12名(6男，6女，20～35歲)具有感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的人員組成評(píng)定小組，事先規(guī)定好評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，以對(duì)發(fā)酵后腥味、鮮香度、協(xié)調(diào)性、醇厚感等主要指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定。然后參照GB/T14454.1—2008[16]、GB/T10220.1—2012[17]與GB/T10221.1—2012[18]進(jìn)行感官評(píng)定。評(píng)定前將經(jīng)冷藏過(guò)的貝肉發(fā)酵液加熱至室溫，并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)號(hào)后讓評(píng)定員打分，評(píng)定員每評(píng)定1個(gè)樣品后需漱口，并休息1 min之后再評(píng)定下1個(gè)樣品，具體評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 合浦珠母貝肉發(fā)酵液感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.7 發(fā)酵液中氨基態(tài)氮含量的測(cè)定

發(fā)酵液中游離氨基氮含量的測(cè)定采用甲醛點(diǎn)位滴定法[19]。

1.3.8 微生物發(fā)酵單因素影響試驗(yàn)

(1)米曲霉和魯氏酵母菌的添加比例對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮的影響

總發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量5%，分別測(cè)定不同菌種比例(米曲霉∶魯氏酵母=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基氮含量的影響。

(2)菌種的接種量對(duì)貝肉發(fā)酵風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮的影響

總發(fā)酵時(shí)間為72 h，發(fā)酵溫度30 ℃，菌種比例1∶1，分別測(cè)定不同菌種添加量2%、3%、4%、5%、6%對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基氮含量的影響。

(3)發(fā)酵溫度對(duì)貝肉發(fā)酵風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮的影響

總發(fā)酵時(shí)間為72 h，菌種比例1∶1，接種量5%，已知米曲霉最適生長(zhǎng)溫度30～35 ℃[20]，魯氏酵母最適溫度為28～30 ℃[21]，因此分別測(cè)定2菌種混合發(fā)酵溫度28、29、30、32、34 ℃時(shí)對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基氮含量的影響。

④發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮的影響

菌種比例1∶1，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量5%，分別測(cè)定不同菌種總發(fā)酵時(shí)間為56、64、72、80、88 h，對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基氮含量的影響。

1.3.9 微生物發(fā)酵正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，研究進(jìn)口溫度(A)、進(jìn)料流量(B)、麥芽糊精添加量(C)3個(gè)因素對(duì)噴霧干燥產(chǎn)品的水分含量及感官評(píng)分的影響，選用正交表L9(34)進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，確定合浦珠母貝肉調(diào)味液噴霧干燥的最佳工藝，正交試驗(yàn)因素與水平如表2所示。

表2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

注：A-米曲霉； B-魯氏酵母菌。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行分析，在檢驗(yàn)水平為0.05的條件下進(jìn)行顯著性差異分析，且所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種添加比例

米曲霉和魯氏酵母菌的添加比例對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著魯氏酵母菌添加比例的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在米曲霉∶魯氏酵母=1∶2時(shí)，貝肉酶解液的風(fēng)味值達(dá)到最高值(76.98±1.12)，但在增加或降低魯氏酵母菌的添加比例時(shí)，風(fēng)味值都會(huì)降低，這可能是因?yàn)榫N比例的變化，導(dǎo)致微生物代謝產(chǎn)物中風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)而影響發(fā)酵液的口感，風(fēng)味值隨之降低[22]。在米曲霉∶魯氏酵母=1∶1時(shí)，貝肉酶解液的游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高值(2.73±0.08) g/L，但在增加或降低魯氏酵母菌的添加比例時(shí)，游離氨基態(tài)氮含量都將會(huì)降低，這因?yàn)榫N的生長(zhǎng)繁殖受多方面影響，接種量并不一定和氨基氮含量呈正相關(guān)[23]。綜合考慮風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮在米曲霉∶魯氏酵母=1∶1和1∶2時(shí)2項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，選取最佳菌種添加比例為1∶2。

圖1 菌種比例對(duì)發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響

Fig.1 Effect of strain ratio on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.2 菌種接種量

菌種接種量對(duì)貝肉發(fā)酵風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著總接種量的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在接種量為5%時(shí)，貝肉酶解液的風(fēng)味值達(dá)到最高值(76.67±0.33)，但在增加或降低菌種添加量時(shí)，風(fēng)味值都會(huì)降低，這可能是因?yàn)榻臃N量的變化，導(dǎo)致發(fā)酵速率及風(fēng)味物質(zhì)含量發(fā)生變化，進(jìn)而影響了發(fā)酵液的風(fēng)味值[24]。在接種量為4%時(shí)，貝肉酶解液的游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高值(2.71±0.13)，但在增加或降低接種量時(shí)，游離氨基態(tài)氮含量都將會(huì)降低，這可能因?yàn)榻臃N量的不足或過(guò)多，導(dǎo)致相應(yīng)微生物代謝不足或自身生長(zhǎng)消耗游離氨基態(tài)氮過(guò)多。相關(guān)研究也證實(shí)了適宜的接種量有利于微生物的生長(zhǎng)，加快發(fā)酵的進(jìn)程[25]。因此綜合考慮風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮2項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，選取最佳接種量為4%。

圖2 接種量對(duì)發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響

Fig.2 Effect of seeding amount on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.3 發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度對(duì)貝肉發(fā)酵風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響

Fig.3 Effect of temperature on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風(fēng)味值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，貝肉酶解液的風(fēng)味值達(dá)到最高值(71.05±0.48)，但在增加或降低發(fā)酵溫度時(shí)，風(fēng)味值都會(huì)降低。而發(fā)酵液中游離氨基態(tài)氮的含量卻隨著溫度的升高而增加，在發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)，貝肉酶解液的游離氨基態(tài)氮含量達(dá)到最高值(3.62±0.09) g/L。這是因?yàn)闇囟瓤捎绊懳⑸锏男玛惔x，升高溫度有利于發(fā)酵的進(jìn)行，但在發(fā)酵溫度達(dá)到34 ℃時(shí)，可能由于溫度過(guò)高導(dǎo)致根霉等雜菌的過(guò)度生長(zhǎng)，產(chǎn)生刺激性氨味[7]，風(fēng)味值大幅下降，因此綜合考慮風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮2項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，選取最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

2.4 發(fā)酵時(shí)間

發(fā)酵時(shí)間對(duì)貝肉發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增大，合浦珠母貝肉酶解液的風(fēng)味值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在發(fā)酵時(shí)間為80 h時(shí)，貝肉酶解液的風(fēng)味值達(dá)到最高值(73.11±1.13)，在增加或縮短發(fā)酵時(shí)間時(shí)，風(fēng)味值都將有所降低。但隨著發(fā)酵時(shí)間的增大，游離氨基態(tài)氮含量卻呈上升趨勢(shì)，但在80 h后，游離氨基酸含量上升幅度不再隨時(shí)間的增加而大幅增大。因此綜合考慮風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮2項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，且提高發(fā)酵效率的情況下，選取最佳發(fā)酵時(shí)間為80 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量的影響

Fig.4 Effect of time on flavor value and free amino nitrogen content of fermented liquor

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合浦珠母貝肉酶解液發(fā)酵工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)試驗(yàn)有較大影響的菌種比(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)4個(gè)因素為考察因子，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以合浦珠母貝肉發(fā)酵液的風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析表3、表4所示。

由表3和表4可知菌種比(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)、發(fā)酵時(shí)間(D)對(duì)合浦珠母貝肉發(fā)酵液的風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量都有不同程度的影響。以上4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵液的風(fēng)味值的影響程度順序?yàn)榫N比例>接種量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度，發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)發(fā)酵液的風(fēng)味值影響不顯著。

表3 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

注：“*”表示顯著影響。

以產(chǎn)品收集率為指標(biāo)通過(guò)K值判斷可知，最優(yōu)條件組合A2B3C2D3。4個(gè)因素對(duì)游離氨基態(tài)氮含量的影響程度的順序?yàn)榫N比例>發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時(shí)間，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離氨基態(tài)氮含量的影響不顯著。以發(fā)酵液的游離氨基態(tài)含量為指標(biāo)通過(guò)T值判斷可知，最優(yōu)組合為A2B2C2D2。分別在2組最優(yōu)組合下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在A2B2C2D2條件下發(fā)酵液的風(fēng)味值及游離氨基態(tài)氮含量都高于A2B3C2D3。因此最終選取最佳發(fā)酵優(yōu)化工藝為A2B2C2D2，即菌種比例1∶2、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間80 h。

3 結(jié)論

該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化合浦珠母貝肉酶解液的發(fā)酵工藝，分別考察菌種比、接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)合浦珠母貝肉發(fā)酵液的風(fēng)味值和游離氨基態(tài)氮含量的影響，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析及對(duì)比，確定最優(yōu)的發(fā)酵工藝。在4因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上確定合浦珠母貝肉酶解液的最佳發(fā)酵工藝條件為：菌種比例(1∶2)、接種量4%、發(fā)酵溫度32 ℃、發(fā)酵時(shí)間80 h，在此條件下，所得發(fā)酵液的風(fēng)味值評(píng)分為96.77，游離氨基態(tài)含量為2.83 g/L。該研究結(jié)果對(duì)以合浦珠母貝肉為原料開(kāi)發(fā)海鮮調(diào)味品及調(diào)味基料過(guò)程中風(fēng)味改良具有重要作用，今后可進(jìn)一步開(kāi)展以合浦珠母貝肉酶解液來(lái)源開(kāi)發(fā)的海鮮調(diào)味品與調(diào)味基料風(fēng)味穩(wěn)定性的研究，以提升合浦珠母取珠后貝肉綜合利用率，對(duì)我國(guó)海水珍珠產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展起到積極促進(jìn)作用。