張俊，王炳文，趙保堂，何興芬，王嬌，楊富民*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州,730020)

乳酸菌是影響宿主健康的主要益生菌之一，有利于調(diào)節(jié)胃腸道平衡，具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用[1]。高發(fā)酵及抗氧化能力的乳酸菌不僅能提升酸奶制作效率,還有助于提升酸奶的抗氧化能力,在食品工業(yè)方面可以改善食品品質(zhì)、延長保質(zhì)期、增加功能特性[2-3]。依據(jù)哈曼的衰老自由基理論(free radical theory of aging, FRTA),機體氧化應(yīng)激和老化密切相關(guān),通過減少氧化損傷可延長壽命[4-5],合成抗氧化劑已被廣泛用于延緩食品脂質(zhì)氧化,但由于對人體肝損傷和致癌等有副作用,使其安全性受到質(zhì)疑[6]。尋找天然與高性價比的食品抗氧化劑以保護細胞免受ROS的影響顯得極其重要[7]。發(fā)酵乳品是我國農(nóng)牧區(qū)的傳統(tǒng)食物，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離高發(fā)酵及高抗氧化能力的乳酸菌株在國內(nèi)外已有較多的研究。DING等[8]從西藏牦牛酸奶中篩選出的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)F17，具有較強的抗氧化能力與耐膽鹽能力，整體可提高食品的抗氧化能力。SHAKIBAIE等[9]從伊朗傳統(tǒng)乳制品中分離的短乳桿菌Lse，具有良好的益生和抗氧化能力。乳酸菌不僅具有降解亞硝酸以保護食品的作用[10]，而且產(chǎn)生的胞外多糖具有優(yōu)良的抗氧化性能[11]。

有研究將乳酸菌的抗氧化性能歸因于傳統(tǒng)食物的發(fā)酵過程[12]，而從自然發(fā)酵牦牛乳中分離到的乳酸菌株的抗氧化特性尚未得到重視。在強烈紫外線輻射的條件下，菌株具備承受氧化應(yīng)激的能力[8]。因此，從高原牦牛酸奶中篩選出高發(fā)酵及抗氧化活性的乳酸菌菌株有十分重要的意義。

本研究通過對甘南地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中高發(fā)酵及抗氧化能力的乳酸菌株的篩選，得到了1株發(fā)酵能力強、菌體抗氧化活性高的副干酪乳桿菌M5，這對開發(fā)我國西部傳統(tǒng)牦牛牧區(qū)的天然乳酸菌種資源、生產(chǎn)功能性乳制品和提高乳品附加值，具有一定的實用和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

在甘南州合作市佐蓋曼瑪鄉(xiāng)不同區(qū)域，采集4份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶。采用無菌注射器吸取樣品，并放進滅菌后的玻璃瓶內(nèi)，密封存放于低溫采樣箱中，24 h之內(nèi)運送回實驗室。

1.1.2 試劑

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),Solarbio；鄰菲啰啉、鄰苯二酚紫、鄰苯三酚,天津市光復(fù)精細化工研究所；MRS、BCP、YPD和MEA培養(yǎng)基采用的各種原料均符合國標。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-B35 高壓滅菌鍋,深圳市佳博特試驗設(shè)備有限公司；JJ-CJ-2FD超凈工作臺,吳江市凈化設(shè)備總廠；TGL-20 高速臺式冷凍離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技服務(wù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

參照劉慧[13]方法，在無菌條件下，取25 mL樣品，加入到含有225 mL無菌水的三角瓶中(含玻璃珠)，振蕩搖勻后進行10倍梯度稀釋，涂布于MRS(含有質(zhì)量分數(shù)為0.5%CaCO3)固體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。挑選出不同形狀并具有溶鈣圈的菌落接種于BCP培養(yǎng)基中，挑選能使BCP培養(yǎng)基由紫變黃的菌落，于MRS培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離純化為單菌落。

1.3.2 乳酸菌革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗和產(chǎn)乳酸定性試驗[14]

將純化后的菌株進行革蘭氏染色和H2O2(3%)觸酶試驗，選擇革蘭氏陽性、H2O2酶陰性試驗的菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，菌懸液經(jīng)4 000 r/min離心取上清液，采用紙層析法進行產(chǎn)乳酸的定性試驗。

1.3.3 篩選具有高過氧化氫耐受能力乳酸菌

參照王楨等[15]方法，將產(chǎn)乳酸的菌株，以3%的量(體積分數(shù))接種于MRS液體培養(yǎng)基中。試驗組中H2O2濃度為1 mmol/L，對照組不進行任何處理。置于37 ℃恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)24 h后，測量菌液在600 nm下的OD值。以耐受率高于60%為依據(jù)，篩選出具有高H202耐受性的菌株。

1.3.4 篩選具有優(yōu)良益生性能與凝乳性能的乳酸菌

1.3.4.1 耐酸耐膽鹽能力測定

參照周晏陽等[16]方法，菌液以2%(體積分數(shù))接種于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為2.0與3.0，另一部分培養(yǎng)基中牛膽鹽的終質(zhì)量分數(shù)為0.3%，將未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)基作為對照，于37 ℃下恒溫培養(yǎng)3 h，采用稀釋涂布平板法分別計算活菌數(shù)，并按公式(1)計算細菌的存活率，即菌株對酸與膽鹽的耐受能力。公式(1)如下所示。

(1)

1.3.4.2 凝乳性能測定

參考羅璠等[17]的方法，取新鮮牛奶4 000 r/min脫脂，95 ℃下滅菌5 min后，放置于42 ℃水浴鍋中。按照3%的接種量(體積分數(shù))分別接入脫脂牛奶后，放入42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，計算各菌種的發(fā)酵凝乳時間。凝乳后放置于4 ℃冰箱中，發(fā)酵24 h后進行形態(tài)基本觀察。

1.3.5 乳酸菌不同組分制備

乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌培液經(jīng)6 000 r/min離心10 min后，分別收集上清液和菌體。上清液經(jīng)過10 000 r/min離心5 min后，再用0.22 μm微孔膜過濾器過濾，即得無細胞的發(fā)酵上清液(cell-free supernatants，CFS)；菌體用無菌水洗滌2～3次，調(diào)整細胞密度OD600=1.0(約為1×109CFU/mL)，將所得菌懸液分為2組，1組作為完整細胞組(intact cells，IC)，另1組在冰浴條件下進行超聲破碎(300 W，25 min，處理5 s，間隔5 s)，經(jīng)鏡檢沒有完整細胞后，進行8 000 r/min離心5 min處理，收集上清液，即可得無細胞提取物(cell free extracts，CFE)。

1.3.6 抗氧化活性的測定

1.3.6.1 DPPH清除率的測定

參考ZHANG[18]與LI等[19]的方法。取樣品1 mL，加入濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液2 mL，混勻后避光反應(yīng)30 min后，在517 nm下測定吸光度，用1 mL蒸餾水和2 mL無水乙醇進行空白調(diào)零。計算見公式(2)。

(2)

式中：Ai，樣品組吸光度；Aj，對照組(乙醇+被測量物質(zhì))吸光度；A0，對照組(水+DPPH)吸光度。

1.3.6.2 ·OH清除率的測定

參考DING等[8]的方法。將1%(質(zhì)量分數(shù))的鄰菲啰啉1 mL加入到離心管中，依次加入2 mL的PBS(0.02 mol/L，pH 7.4)，1 mL蒸餾水，1 mL 2.5 mmol/L FeSO4，1 mL 20 mmol/L H2O2，于37 ℃恒溫水浴1.5 h。計算見公式(3)。

(3)

式中：Ap，在536 nm下測吸光度；As,1 mL樣品代替1 mL蒸餾水的吸光度；Ab,1 mL蒸餾水代替1 mL H2O2吸光度。

參考陳明等[20]的方法，取2.8 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)溶液，加入0.1 mL鄰苯三酚(0.05 mol/L)和0.1 mL樣品。將反應(yīng)液混勻，于25 ℃避光反應(yīng)4 min后。迅速添加1 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)，在320 nm下測吸光度。按公式(4)計算。

(4)

式中：A0，沒有添加樣品的空白對照；Ai，添加樣品的吸光度。

1.3.7 酵母存活細胞模型測定

參考林祥娜[21]的方法并做修改，將意大利Enartis公司的紅佳釀酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)12 h。將制備好的無細胞上清液、完整細胞組和破壁細胞在沸水中滅菌20 min。吸取0.1 mL酵母菌于5 mL的滅菌樣品中，于28 ℃搖床培養(yǎng)1 h后，加入終濃度為30 mmol/L的H2O2。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，吸取0.1 mL的菌懸液進行梯度稀釋，并涂布于MEA培養(yǎng)基上計數(shù)，如公式(5)。

(5)

式中：處理組，采用CFS、IC、CFE分別和H2O2處理；對照組，只用H2O2進行處理。

1.3.8 益生性與抗氧化菌株的鑒定

1.3.8.1 菌株生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[22]對菌株進行初步鑒定。

1.3.8.2 16S rDNA鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將對數(shù)期的菌株用甘油保存好，送樣于青島派森諾基因生物科技有限公司進行菌種測序鑒定，包括細菌基因組DNA的提取、PCR的擴增、PCR產(chǎn)物的回收、序列的測定與回收。得到序列結(jié)果后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，并用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010分析處理數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次試驗所得，并計算平均值和標準誤差，繪制圖表；采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化與初篩

從甘南傳統(tǒng)牦牛酸奶中初篩得到了18菌株，都具有較大溶鈣圈并使BCP培養(yǎng)基由紫變黃的能力；經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)有13株菌呈現(xiàn)出革蘭氏陽性；H2O2觸酶陰性；菌株發(fā)酵液的Rf值為0.7～0.8。進一步篩選發(fā)現(xiàn)，9株在1 mmol/L H2O2中的耐受率高于60%，結(jié)果見表1。

表1不同菌株初篩結(jié)果

注：“+”代表陽性;“-”代表陰性;Rf為樣品與2 %乳酸移動路徑的比值。

2.2 耐酸、耐膽鹽及凝乳性試驗

不同的菌株在pH 2.0與pH 3.0的生長環(huán)境下表現(xiàn)出不同的耐受性，存活率整體隨pH值升高呈現(xiàn)上升趨勢。在pH值為2.0的存活率為8.5%～25.5%。pH值為3.0的存活率為14.2%～70.2%，其中菌株M8在pH=3條件下存活率高達70%。大部分菌株耐膽鹽效果較好，存活率在高達30%以上。其中6株菌株的凝乳時間較短，凝乳時間為5～9 h，菌株M5的凝乳時間為6.2 h，表現(xiàn)出較好的凝乳發(fā)酵性能(表2)。

表2 不同菌株耐酸耐膽鹽與凝乳性能

注：同一處理的不同小寫字母表示處理內(nèi)的差異顯著(P<0.05)。

2.3 抗氧化比較

2.3.1 DPPH自由基清除率

如圖1所示，6株乳酸菌的CFS、IC和CFE處理組均表現(xiàn)出了DPPH自由基清除能力，但不同菌株對DPPH自由基清除能力表現(xiàn)不同。CFS和CFE組中較強清除能力的為M5，IC組中清除能力較強的為T4和M11?？傮w來看，菌株M5的DPPH自由基清除能力最強，其中CFS處理組中清除率高達47.8%，顯著高于其他菌株的CFS處理組，其IC組合CFE組的清除率分別為42.7%和48.4%。

圖1 各菌株對DPPH自由基的清除效果

Fig.1 DPPH radical-scavenging ability of 6 screened strains

注：同一處理的不同小寫字母表示處理內(nèi)的差異顯著(P<0.05)。(以下各圖與此相同)。

2.3.2 ·OH自由基清除率

由圖2可知，M5的CFS組對·OH的清除率為54.4%顯著高于其他組；CFE組中M8的清除能力較高為29.3%；IC組中M5、M8和Mx表現(xiàn)出較高的清除能力，分別為36.9%、34.4%和33.5%。相同菌株的·OH自由基清除能力中，CFS處理組高于IC和CFE處理組，乳酸菌清除羥自由基的活性物質(zhì)主要存在菌體表面以及代謝產(chǎn)物中而非胞內(nèi)。

圖2 各菌株對·OH自由基清除結(jié)果

Fig.2 Hydroxyl radical-scavenging ability of 6 screened strains

圖3 各菌株對的清除效果

以菌株的抗氧化能力為主，結(jié)合菌株的耐酸性以及高耐膽鹽和凝乳發(fā)酵性能，綜合選擇M5菌株進行后續(xù)試驗。

2.4 酵母存活細胞模型

酵母細胞的衰老代謝機制與人體細胞衰老機制相似[23]。在研究氧化應(yīng)激損傷中，釀酒酵母是理想的生物模型，具有簡單而獨特的生長代謝規(guī)律[24]。由圖4可知，在加入乳酸菌的發(fā)酵上清液、完整細胞組和無細胞提取物后，經(jīng)H2O2處理的酵母細胞的增長率都有所提高。增長率分別為130%、29%和95%，其中菌株M5的發(fā)酵上清液的氧化應(yīng)激保護作用更加明顯，其增長率高達130%。

圖4 菌株M5對酵母細胞的保護

Fig.4 Protective effect of strains on S. cerevisiae

2.5 菌株形態(tài)生理生化鑒定

在MRS培養(yǎng)基上，菌株M5呈現(xiàn)乳白色圓形菌落；長度為1～2 μm，表面光滑濕潤凸起，邊緣整齊；為革蘭氏陽性、無芽孢、細長有彎曲的桿菌。通過該菌株的兼性厭氧觸媒試驗陰性、兼性異型發(fā)酵乳糖、不液化明膠的結(jié)果。根據(jù)《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》初步將M5菌株鑒定為乳桿菌屬(表3)。

表3 菌株M5生理生化鑒定結(jié)果

注：“+”表示90%以上菌株為陽性；“-”表示90%以上出來為陰性；“d”表示 11%～89%菌株為陽性。

2.6 分子生物學(xué)鑒定

由于干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌等其他亞種親緣關(guān)系接近，很難利用傳統(tǒng)的發(fā)酵特性再進一步的區(qū)分，因此需要將表型特征和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來對其進行鑒定[25]。目前在菌種鑒定中應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)是16S r DNA序列同源分析。將測序得到的序列在NCBI中進行同源性比對，并用MEGA5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見下圖5。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，M5菌株與副干酪乳桿菌JCM1171處于同一小分支，親緣關(guān)系最近，這跟形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果一致(圖6)。因此可以進一步將M5菌株確定是副干酪乳桿菌。

圖5 菌株M5的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.5 Phylogenetic tree of strain M5

圖6 菌株M8、T4和M5的16S rRNA基因PCR擴增效果

Fig.6 Amplification of 16S rRNA gene of strains M8，T4 and M5 by PCR

3 討論

菌種的發(fā)酵性能直接關(guān)系到酸奶質(zhì)量的好壞[26]，不僅影響酸奶的生產(chǎn)效率，而且影響酸奶的風(fēng)味物質(zhì)形成。發(fā)酵性能強的菌株，使牛奶中酸度下降過快，不利于凝乳質(zhì)地的構(gòu)建與后發(fā)酵中風(fēng)味物質(zhì)的形成，發(fā)酵時間過長則直接影響生產(chǎn)效率。凝乳時間是酸奶生產(chǎn)中非常重要的指標之一，對于工業(yè)化生產(chǎn)而言，一般要求發(fā)酵乳凝乳時間在5 h左右[27]。試驗篩選的菌株凝乳時間為6.2 h，低于市場上的商業(yè)菌株。菌株的凝乳狀態(tài)光滑細膩，可以通過后期的馴化和制備直投式發(fā)酵劑以增加菌株的發(fā)酵性能，用于工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論