耿曉杰，張玉紅，薛潔，孫紀(jì)錄，閆寅卓*

1(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定，071001) 2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與食品科學(xué)研究所，西藏拉薩，850032) 4(酒類(lèi)品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京，100015)

傳統(tǒng)青稞酒是以西藏糧食作物青稞為原料，加入青稞小曲糖化發(fā)酵而成，是西藏酒文化的代表，具有口感適宜、酒精度低以及營(yíng)養(yǎng)功效高等特點(diǎn)[1]。

青稞小曲是采用傳統(tǒng)自然接種方式制作的釀酒發(fā)酵劑，含有豐富的微生物及酶[2]，參與釀酒過(guò)程中的糖化、液化、酒精發(fā)酵和風(fēng)味的形成[3-4]。所以，青稞小曲中的微生物很大程度上決定了青稞酒的品質(zhì)和風(fēng)味。目前，由于地理位置、釀造工藝、制曲原料和環(huán)境等因素的影響致使青稞小曲質(zhì)量不穩(wěn)定[5-6]。

傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法，如微生物計(jì)數(shù)，使用不同的普通和選擇性培養(yǎng)基，可以提供可培養(yǎng)的不同微生物數(shù)量以及用于酒發(fā)酵的分離的純培養(yǎng)菌株[7]。本文收集了來(lái)自西藏5個(gè)地區(qū)的21個(gè)青稞小曲樣品，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)微生物進(jìn)行分離鑒定，并篩選淀粉酶活力和蛋白酶活力高的菌種，為豐富青稞小曲中微生物菌群的研究，以及生產(chǎn)適合西藏地區(qū)青稞酒釀造的小曲，穩(wěn)定和提升青稞酒的品質(zhì)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

青稞小曲：21種，均由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院提供，樣品信息如表1所示。

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PCA)培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

產(chǎn)糖化酶菌株初篩培養(yǎng)基[8]、產(chǎn)蛋白酶菌株初篩培養(yǎng)基[9]、麩皮培養(yǎng)基[1]。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒，天根生化試劑公司；6× Loading Buffer(上樣緩沖液)、10× PCR Buffer、Tap酶、DL5 000 DNA Marker，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；Gold View(核酸染色劑)，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；通用引物(27F和1492R、ITS-1和ITS-4)，由華大基因公司合成；西班牙瓊脂糖，北京索萊寶科技有限公司；乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.6)，可溶性淀粉溶液(20 g/L)、NaOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.5 g/L)、費(fèi)林溶液、酪氨酸，HCl、0.4 mol/L Na2CO3溶液、福林試劑、pH 7.5磷酸鹽緩沖液、pH 3.0乳酸緩沖液、脫脂奶粉、0.4 mol/L三氯乙酸溶液、碘液，試劑均為分析純，北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；

表1 青稞小曲樣品的信息

注：“-”表示只精確到地區(qū)具體位置信息未定。

BX51顯微鏡，奧林巴斯(中國(guó))有限公司；LRH-250培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BC-C57 PCR儀，北京天林恒泰科技有限公司；BG-sub MIDI多用途水平電泳儀、BG-Power600通用電泳儀電源，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品中微生物的分離與純化

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g粉碎的青稞小曲樣品，無(wú)菌操作下，加入99 mL無(wú)菌生理鹽水(0.9%)中，振蕩2 min，使微生物均勻分散于生理鹽水中，制成10-2稀釋度的菌懸液，混合均勻，吸取1 mL 10-2菌懸液于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，制成10-3菌懸液，混合均勻，依次作10倍逐級(jí)稀釋?zhuān)瞥?0-4、10-5、10-6、10-7菌懸液[10]。取適宜的3個(gè)稀釋度的菌懸液100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基上用于細(xì)菌菌落的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)；涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上用于真菌菌落的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，每種培養(yǎng)基的每個(gè)稀釋度都進(jìn)行平行試驗(yàn)并做空白對(duì)照以確保準(zhǔn)確性。對(duì)于細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)3 d，對(duì)于真菌，28 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)菌落，結(jié)果表示為每克樣品的菌落形成單位(colony-forming units，CFU)的對(duì)數(shù)(lg CFU/g)。另外，選取形態(tài)不同的菌落，進(jìn)行劃線分離純化，并保藏于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 菌落與菌體形態(tài)的觀察

對(duì)分離純化的菌落進(jìn)行觀察和描述；挑取純化的菌落于載玻片上，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[10]。

1.3.3 微生物的分子生物學(xué)鑒定

1.3.3.1 DNA的提取

分別用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒和植物基因組DNA提取試劑盒對(duì)分離純化的細(xì)菌、酵母菌和霉菌DNA進(jìn)行提取，提取步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，DNA模板1 μL，Taq酶0.3 μL，(細(xì)菌：27F；真菌：ITS1)上游引物1 μL，(細(xì)菌：1492R；真菌：ITS4)下游引物 1 μL，用ddH2O 補(bǔ)至25 μL[11-12]；

細(xì)菌反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性 45 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 35 s(35次循環(huán))，最后72 ℃延伸5 min[13]。

真菌反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性45 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s(35次循環(huán))，最后72 ℃延伸8 min[14]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，120 V，20 min，恒壓對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳[15]，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，照相分析。

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3.3.3 序列分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)nucleotide中進(jìn)行Blast比對(duì)分析；另外，用ContigExpress軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接及人工校正，生成Fasta格式文件，利用Mega 7軟件按照Neighbor-Joining法聚類(lèi)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 優(yōu)良細(xì)菌、霉菌菌株的篩選

1.3.4.1 初篩

用無(wú)菌牙簽蘸取平板上的菌株點(diǎn)接于產(chǎn)糖化酶初篩培養(yǎng)基上，霉菌，28 ℃培養(yǎng)72 h；細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)48 h；測(cè)量菌落直徑D，向培養(yǎng)皿中加入4 mL稀碘液，5 min后，測(cè)量透明圈直徑d，選擇比值d/D較大的菌株點(diǎn)接于產(chǎn)蛋白酶初篩培養(yǎng)基上，測(cè)量細(xì)菌菌落直徑D和透明圈直徑d，選擇比值d/D較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩[16]。

1.3.4.2 復(fù)篩

(1)霉菌孢子懸浮液的制備：于活化的菌株斜面倒入10 mL的無(wú)菌生理鹽水，用接種針刮下斜面上孢子，將試管中的孢子打散混勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并稀釋孢子數(shù)至106個(gè)/mL左右[17]。

(2)細(xì)菌種子液的制備：挑取1環(huán)細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min，培養(yǎng)12 h[18]。

(3)接種培養(yǎng)：種子液/懸浮液按10% 的接種量接入麩皮培養(yǎng)基，混勻，細(xì)菌，37 ℃培養(yǎng)3 d(每天搖瓶2次)；霉菌，28 ℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)行扣瓶，繼續(xù)培養(yǎng)至6 d。于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，40 ℃烘干12 h，備用[19-20]。

(4)按照QB/T 4257—2011測(cè)定麩曲的糖化力、液化力，按照GB/T 23527—2009測(cè)定蛋白酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)

將收集的西藏青稞小曲樣品通過(guò)稀釋涂布培養(yǎng)，選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板計(jì)數(shù)可培養(yǎng)微生物總數(shù),結(jié)果如表2所示。

表2 青稞小曲中可培養(yǎng)微生物計(jì)數(shù)結(jié)果

由表2可知，除了QK2外，其他青稞小曲的可培養(yǎng)微生物數(shù)均在108CFU/g左右，而湖北、安徽和四川地區(qū)小曲以及貴州黃酒酒曲和麥曲中可培養(yǎng)微生物數(shù)為106～107CFU/g左右[21-22]，表明青稞小曲樣品中的可培養(yǎng)微生物數(shù)量較多。

2.2 微生物的分離純化結(jié)果

選取涂布培養(yǎng)的平板上不同形態(tài)的菌落，通過(guò)劃線分離得到單一菌落。菌落形態(tài)如圖1所示。

圖1分別為酵母菌(a)、霉菌(b)和細(xì)菌(c)分離純化后的形態(tài)，其中，酵母菌比細(xì)菌菌落形態(tài)大，圓形，菌落呈白色，濕潤(rùn)，菌落質(zhì)地均勻，易挑取，有酒香味；霉菌菌落形態(tài)大，呈絨毛狀，菌落為黑白相間，質(zhì)地疏松，干燥，菌落正面與反面的顏色不一致；細(xì)菌菌落形態(tài)小，隆起圓，菌落呈白色，表面光滑黏稠，易挑取，有酸敗味。另外，經(jīng)傳統(tǒng)的分離純化培養(yǎng)法自西藏青稞小曲21個(gè)樣品中共分離純化得到優(yōu)勢(shì)微生物278株。

a-酵母菌;b-霉菌;c-細(xì)菌

圖1 部分微生物的菌落形態(tài)

Fig.1 Colony morphology of partial microorganisms

2.3 菌落分子生物學(xué)鑒定結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)純菌株的菌落和菌體形態(tài)的觀察，挑選出57個(gè)單菌落進(jìn)行鑒定。使用相應(yīng)的試劑盒提取純菌株的DNA，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測(cè)后，將電泳條帶較清晰、符合真菌(500～750 bp)或細(xì)菌的條帶長(zhǎng)度(1 500～2 000 bp)的菌株送檢測(cè)序，圖2為部分菌株瓊脂糖凝膠電泳圖；然后對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接及人工校正，再利用Mega 7和鄰接法對(duì)測(cè)序菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

M-DL5000 DNA marker；1，2，3，4，5和6分別代表霉菌M6和M12、酵母菌J1和J2以及細(xì)菌Q11和Q12

圖2 部分菌株的16S rRNA(細(xì)菌)和ITS基因(真菌)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rRNA (bacteria) and ITS gene (fungi) from partial strains

圖2顯示，所擴(kuò)增的目的片段電泳條帶較清晰，真菌條帶大小約為600 bp，符合真菌的條帶長(zhǎng)度，細(xì)菌條帶大小約為1 500 bp，符合細(xì)菌的條帶長(zhǎng)度，送檢測(cè)序，并將結(jié)果通過(guò)NCBI nucleotide中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，鑒定結(jié)果如表3所示。

由表3可知，從青稞小曲中分離出的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌分別是蠟樣芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和Kocuriamarina；真菌分別為扣囊復(fù)膜孢酵母、釀酒酵母、Saccharomycop-sismalanga、米根霉、Coriolopsistrogii、卷枝毛霉、總狀毛霉、白囊耙齒菌、傘狀毛霉菌、米曲霉、黃曲霉、黑曲霉和毛栓菌。研究結(jié)果表明，西藏青稞小曲中真菌多樣性高于細(xì)菌，芽孢桿菌屬、復(fù)膜孢酵母屬和根霉屬是青稞小曲中的主要菌群。另外，湖北、安徽和四川地區(qū)小曲中均含有芽孢桿菌[21]，其也是低溫大曲和高溫大曲中的優(yōu)勢(shì)菌[23-24]。說(shuō)明芽孢桿菌對(duì)于酒曲的穩(wěn)定和酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生具有很大的作用。CAI等研究結(jié)果表明根霉菌是中國(guó)甜米酒發(fā)酵劑中的優(yōu)勢(shì)菌，并對(duì)釀造過(guò)程中的淀粉水解具有重要作用[25]；CHI等發(fā)現(xiàn)扣囊復(fù)膜酵母能夠分泌大量的淀粉酶、酸性蛋白酶和β -葡萄糖苷酶，在發(fā)酵行業(yè)具有很高的潛在利用價(jià)值[26]。因此，青稞小曲中篩選的優(yōu)勢(shì)菌屬為優(yōu)化制曲工藝提供了研究基礎(chǔ)。

表3 青稞小曲中微生物鑒定結(jié)果

由圖3可知，菌株M16和M23、X1和X2、J5和J8、M3和M9、QJ2和QJ3遺傳距離較近，表明親緣關(guān)系較近，而其他菌株的遺傳距離較遠(yuǎn)，則菌屬差異較大，另外，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明了青稞小曲中微生物的多樣性。

圖3 西藏青稞小曲中微生物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.3 Phylogenetic tree for microbials in highland barley Xiaoqu

2.4 優(yōu)良微生物的篩選

2.4.1 優(yōu)良霉菌菌株的初篩

2.4.1.1 產(chǎn)糖化酶霉菌菌株的初篩

小曲中的霉菌主要起糖化作用，將原料中的淀粉轉(zhuǎn)化成還原糖用于其他微生物生長(zhǎng)利用，本研究通過(guò)在含有可溶性淀粉的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)分解淀粉的霉菌菌株，利用淀粉遇碘變藍(lán)的原理[27]，快速初篩得到糖化力較強(qiáng)的霉菌菌株，糖化透明圈如圖4所示，產(chǎn)糖化酶菌株初篩結(jié)果如表4所示。

表4 霉菌產(chǎn)糖化酶菌株初篩結(jié)果

注：“-”表示未有透明菌產(chǎn)生。下同。

糖化酶初篩培養(yǎng)基中以可溶性淀粉為唯一碳源，以碘作為顯色劑，平板中透明圈越大說(shuō)明淀粉被糖化酶分解的越多，糖化酶活力越高，反之，越低。從表4中可以看出，霉菌菌株M1、M2、M4、M9、M14和M20未出現(xiàn)糖化透明圈，菌株M18、M21、M22和M23的d/D比值較小，而M3、M5、M6、M7、M8、M10、M12、M13、M15、M16和M19是相對(duì)糖化透明圈較大的11株霉菌菌株，表明這些菌株的糖化酶活力較高，所以，選取這11株菌進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶菌株初篩。

2.4.1.2 產(chǎn)蛋白酶霉菌菌株的初篩

研究表明，酒中的高級(jí)醇，主要來(lái)源于蛋白酶分解蛋白質(zhì)所生成的氨基酸，另外，酒中的高級(jí)醇及其派生出來(lái)的酸、醛、酮和酯等，都是酒香氣的重要組分[9]。

所以，本研究通過(guò)在含有脫脂奶粉的篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)分解蛋白質(zhì)的霉菌菌株，初篩得到糖化力較強(qiáng)且蛋白酶活力較強(qiáng)的霉菌菌株，產(chǎn)蛋白酶透明圈如圖4所示，產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果如表5所示。

蛋白酶初篩培養(yǎng)基中以脫脂奶粉為氮源，平板中透明圈越大說(shuō)明脫脂奶粉被蛋白酶酶分解的越多，蛋白酶活力越高，反之，越低。由表5可得，除了霉菌菌株M5和M10無(wú)透明圈產(chǎn)生，其他菌株均有產(chǎn)蛋白酶的透明圈，本實(shí)驗(yàn)擬篩選發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株。因此，選取糖化酶活力和蛋白酶活力都較高的菌株M3、M6、M7、M8、M12、M13、M15、M16和M19進(jìn)行優(yōu)良霉菌菌株復(fù)篩。

表5 霉菌產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果

a-霉菌糖化透明圈;b-細(xì)菌糖化透明圈;c-霉菌產(chǎn)蛋白酶透明圈;d-細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶透明圈

圖4 部分微生物糖化和產(chǎn)蛋白酶透明圈

Fig.4 Transparent circles of saccharification and protease-producing of partial microorganisms

2.4.2 優(yōu)良霉菌菌株的復(fù)篩

將初篩得到的9株霉菌菌株分別制成麩曲，測(cè)定霉菌麩曲具體的糖化力、液化力和蛋白酶活力值。

2.4.2.1 糖化力的測(cè)定

糖化酶可從淀粉的非還原性末端開(kāi)始依次水解α - 1,4 -葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖，常應(yīng)用于微生物發(fā)酵中。在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g曲1 h轉(zhuǎn)化可溶性淀粉生成葡萄糖的質(zhì)量，用費(fèi)林試劑測(cè)定所生成的葡萄糖量，即為糖化力。結(jié)果如圖5所示。

圖5 9株霉菌糖化力測(cè)定結(jié)果

Fig.5 Determination results of saccharifying power of 9 molds

青稞小曲作為發(fā)酵青稞酒的糖化、發(fā)酵和生香劑，對(duì)酒體品質(zhì)影響極大。糖化力是評(píng)價(jià)酒曲質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，糖化力較高有利于對(duì)原料的充分利用且有利于提高出酒率。從圖5中可以看出，菌株M12、M7、M8和M19糖化力較高，糖化力分別為(1 382±77.38)、(1 294±91.85)、(1 288±89.8)、(1 055 ±48.88)mg/(g·h)，其他5株霉菌糖化力均低于1 000 mg/(g·h)，其中M3最低，糖化力為124±54.11 mg/(g·h)。

2.4.2.2 液化力的測(cè)定

液化酶能使淀粉由高分子狀態(tài)(淀粉顆粒)轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低分子狀態(tài)(糊精)，在酒發(fā)酵過(guò)程中尤為重要。而在35 ℃、pH 4.6條件下，1 g曲酶解1 h至試液對(duì)碘的藍(lán)紫色特征反應(yīng)消失，根據(jù)所需時(shí)間可以計(jì)算液化的淀粉質(zhì)量，即為液化力。結(jié)果如圖6所示。

圖6 9株霉菌液化力測(cè)定結(jié)果

Fig.6 Determination results of liquefying power of 9 molds

從圖6中可以看出，M16液化力最高，達(dá)到(4.65±0.25)g/(g·h)，其次為M15、M19、M7、M12，液化力分別為(1.85±0.07)、(1.78±0.01)、(1.6±0.05)、(1.39±0.05)g/(g·h)，其他菌株的液化力均小于1 g/(g·h)，液化力較高的青稞小曲可以促進(jìn)對(duì)釀酒原料的利用率。

2.4.2.3 蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶能夠水解原料中的蛋白質(zhì)，增加碳源和氨基酸，加速其他微生物生長(zhǎng)和風(fēng)味氨基酸的產(chǎn)生[28]，由于釀酒過(guò)程中，pH值處于中性或者酸性環(huán)境中，所以，利用L-酪氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Folin-酚法[29]測(cè)定霉菌麩曲的中性和酸性蛋白酶活力。結(jié)果如圖7、圖8所示。

圖7 9株霉菌中性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

Fig.7 Determination results of neutral protease activity of 9 molds

蛋白酶活力主要的作用是降解原料中的蛋白質(zhì)，從而分解為風(fēng)味氨基酸等，促成青稞酒終產(chǎn)品的風(fēng)味。從圖7中可以看出，除了菌株M8、M16、M15和M13中性蛋白酶活力較低外，其他菌株中性蛋白酶活力都比較高，其中，菌株M19、M6、M12、M3均高于800 μg/(g·min)，中性蛋白酶活力分別為(944.51±13.49)、(881.82±6.36)、(869.87±56.75)、(826.88±213.9)μg/(g·min)。

圖8 9株霉菌酸性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

Fig.8 Determination results of acid protease activity of 9 molds

由圖8可知，M13、M6、M3、M19、M12的酸性蛋白酶活力較高，分別為(531.85±3.09)、(285.33±5.38)、(174.19±49.41)、(158.31±57.51)、(81.02±20.68)μg/(g·min)，其他菌株均低于50 μg/(g·min)。結(jié)合糖化力、液化力和蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果，再加上霉菌在發(fā)酵過(guò)程中主要起糖化作用，M12糖化酶活力最高，為(1 382±77.38)mg/(g·h)，其他酶活力較強(qiáng)，所以，發(fā)酵性能優(yōu)良且適用于發(fā)酵的菌株是M12。

2.4.3 優(yōu)良細(xì)菌菌株初篩

2.4.3.1 產(chǎn)糖化酶細(xì)菌菌株的初篩

研究表明，酒在糖化過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌通過(guò)環(huán)境誘導(dǎo)可產(chǎn)生耐高溫淀粉酶菌，有利于青稞酒的釀造生產(chǎn)[30]，所以，本研究通過(guò)糖化透明圈對(duì)細(xì)菌中產(chǎn)糖化酶菌株進(jìn)行了初篩，細(xì)菌糖化透明圈如圖4所示，結(jié)果如表6所示。由表6可知，細(xì)菌菌株X1、X2、Q3、Q5和Q8無(wú)糖化透明圈產(chǎn)生，選擇產(chǎn)生透明圈的菌株Q1、Q2、Q4、Q7、Q9、Q10、Q11、Q12和X4進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶菌株初篩，而且由表4和表6可得，可能是由于霉菌菌絲較發(fā)達(dá)，所以，細(xì)菌相對(duì)透明圈高于霉菌。

表6 細(xì)菌產(chǎn)糖化酶菌株初篩結(jié)果

2.4.3.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌菌株的初篩

通過(guò)產(chǎn)蛋白酶透明圈試驗(yàn)，初篩得到糖化力較強(qiáng)且蛋白酶活力較強(qiáng)的細(xì)菌菌株，細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶透明圈如圖4所示，產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果如表7所示。

表7 細(xì)菌產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果

由表7可知，產(chǎn)生糖化透明圈的細(xì)菌菌株中，只有X4和Q4產(chǎn)生蛋白酶篩選透明圈，說(shuō)明沒(méi)有蛋白酶活力，或蛋白酶活力較低，所以選擇X4和Q4進(jìn)行優(yōu)良細(xì)菌菌株復(fù)篩。

2.4.4 優(yōu)良細(xì)菌菌株復(fù)篩

由于細(xì)菌在青稞酒發(fā)酵過(guò)程中主要是產(chǎn)香類(lèi)物質(zhì)的作用，所以本研究將初篩得到的2株細(xì)菌菌株分別制成麩曲，只測(cè)定了細(xì)菌麩曲的蛋白酶活力，結(jié)果如表8所示。細(xì)菌菌株X4和Q4中性蛋白酶活力都較高，但是，菌株Q4略高于X4，且菌株Q4具有酸性蛋白酶活力，所以，發(fā)酵性能優(yōu)良的細(xì)菌菌株是Q4。

表8 2株細(xì)菌酸性蛋白酶活力和中性蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法計(jì)數(shù)了西藏青稞小曲中可培養(yǎng)微生物，分離得到278株菌，其中細(xì)菌56株，真菌222株，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，將篩選出的57株菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌3株，沙福芽孢桿菌6株，短小芽孢桿菌2株，蘇云金芽孢桿菌，解淀粉芽孢桿菌和Kocuriamarina各1株；真菌分別為扣囊復(fù)膜孢酵母13株，釀酒酵母2株，S.malanga七株，米根霉11株，C.trogii兩株，卷枝毛霉、總狀毛霉、白囊耙齒菌、傘狀毛霉菌、米曲霉、黃曲霉菌、黑曲霉和毛栓菌各1株。研究結(jié)果表明，西藏青稞小曲中真菌多樣性高于細(xì)菌，其優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬、復(fù)膜孢酵母屬和根霉屬。通過(guò)透明圈法初篩和制曲復(fù)篩，得到中性蛋白酶活力最高為(1 035.56±40.09)μg/(g·min)，具有酸性蛋白酶活力的解淀粉芽孢桿菌1株以及糖化酶活力最高為(1 382±77.38)mg/(g·h)，液化力、蛋白酶活力都較高的米根霉1株。