李寧寧，張波，牛見明，史肖，閆浩凱，韓舜愈

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州，730070)

紅葡萄酒顏色不僅是評價紅葡萄酒質(zhì)量的重要指標，也是消費者購買葡萄酒時重要的參考因素?；ㄉ?anthocyanins)是賦予葡萄酒顏色特性的一類天然色素，對葡萄酒的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。葡萄中的花色苷主要存在于紅色葡萄的果皮中，其加工的食品因其特有的強烈色彩(主要是紅色、藍色和紫色的貢獻)和相關(guān)的健康益處而成為人們備受青睞的色素化合物[1-3]。然而，由于它們有著缺電子的黃烊陽離子這種獨特的化學結(jié)構(gòu)導致該分子高度不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解使得顏色損失。此外，花色苷還受到外界一些因素(pH，溫度，光，亞硫酸鹽等)、花青素-3-O-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)、其他酚類化合物、加工和儲存條件等的影響[4-5]?；ㄉ赵谒芤褐蓄伾娘@示強烈依賴于溶液的pH值，隨著pH值的改變，花色苷以不同的結(jié)構(gòu)形式在溶液中動態(tài)轉(zhuǎn)換。在pH<2時，紅色黃烊陽離子占主導地位，隨著pH值的增加，其他花色苷型式在平衡狀態(tài)下轉(zhuǎn)化形成(半縮酮，查耳酮和醌型堿)[6]。若依據(jù)其在pH中的轉(zhuǎn)化機制，花色苷在弱酸性水醇溶液中主要以無色水合半縮酮形式存在，呈現(xiàn)略帶顏色或幾乎無色的狀態(tài)。然而，在紅葡萄酒中(pH 3.2～4.0)，花色苷即使在弱酸性pH下也能表現(xiàn)出強烈的紅色、藍色或紫色。這說明葡萄酒溶液中存在一些穩(wěn)定機制能夠賦予葡萄酒理論之外的顏色特性，這些機制被描述為輔色作用(copigmentation)，是植物和食品中的主要顏色穩(wěn)定機制[7]。

輔色作用是花色苷的平面可極化核與輔色素(無色或具有富電子π-系統(tǒng)的酚類化合物)之間通過范德華力相互作用形成花色苷-輔色素復合物，該復合物采用夾心狀結(jié)構(gòu)將花色苷保護在中間，可穩(wěn)定黃烊陽離子發(fā)色團，并部分保護其免受水分子的親核攻擊、減少無色半縮酮和查耳酮型式的形成，從而防止顏色損失[6]。輔助呈色作用主要包括分子內(nèi)輔色作用、分子間輔色作用、自聚合和金屬絡(luò)合作用。紅葡萄酒中主要以分子間輔色作用和分子內(nèi)輔色作用為主。分子間輔助呈色作用指的是輔色素與花色苷之間以非共價鍵和氫鍵結(jié)合，形成垂直層疊或水平的復合產(chǎn)物。分子內(nèi)輔色作用是中心花色苷發(fā)色團和其糖基部分共價連接的芳香?；鶜埢肿油ㄟ^糖基的折疊共平面相互作用，保護花色苷發(fā)色團免受水分子的親核侵襲[7-8]。輔色作用通常伴隨著增色效應(其中吸光值A(chǔ)max的增加)或/和紅移效應(其中發(fā)生在吸收光譜的最大吸收波長λmax的偏移)，同時也有文獻報道添加輔色素可以延長花色苷半衰期[3,7,9]。研究證實在李子汁模擬溶液中探討了花色苷和蘆丁的輔色能力，結(jié)果顯示蘆丁能夠提高顏色的穩(wěn)定性[10]。HAN等[11]研究了花色苷結(jié)構(gòu)在醇水溶液中的自締合作用對顏色的影響。目前為止，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷與其他輔因子(阿魏酸，兒茶素，表兒茶素，槲皮素，原花青素，咖啡酸等)在模擬溶液中的輔色作用多有報道[12-15]，但其他幾種基本花色苷的輔色能力很少或未見報道[11,16-17]，這使得很難評估各個基本花色苷對葡萄酒的貢獻，也很難將結(jié)果外推到紅葡萄酒中。羥基苯甲酸的特征在于它們的C6-C1結(jié)構(gòu)，它們是葡萄和葡萄酒中最具代表性的酚酸類之一[15,18]，而原兒茶酸是葡萄籽中含量較為豐富的苯甲酸類化合物[19]。因此，了解原兒茶酸作為不同花色苷輔因子的能力也是非常重要的。

為了明確不同結(jié)構(gòu)花色苷和不同輔色素濃度改善干紅葡萄酒顏色和穩(wěn)定其色澤的機制，本實驗在模擬葡萄酒中評估了不同輔色素濃度和顏色演變的關(guān)系，探討了花色苷B環(huán)含有不同取代基種類和數(shù)量的5種基本花色苷的輔色能力以及對顏色演變的影響，有助于我們明晰干紅葡萄酒顏色與輔色素濃度以及花色苷結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，探明不同摩爾比下不同花色苷結(jié)構(gòu)的作用效果，以便為后續(xù)研究提供關(guān)于花色苷結(jié)構(gòu)和顏色之間關(guān)系的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、輔色素原兒茶酸(純度均≥98%)：購自美國Sigma公司；無水乙醇(色譜純)、NaCl、酒石酸(分析純)：購自上海源葉生物科技有限公司。

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；KO-500E型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；JXMIN-80生物指示器，衢州新芝生物科技有限公司；旋渦混合振蕩器，南京東邁科技儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模擬酒溶液的配制

模擬溶液配制方法參照ZHANG等[20]，稱取酒石酸5 g于燒杯中充分溶解并定容到1 L的容量瓶中配得12%vol的模擬酒溶液，用NaCl調(diào)節(jié)模擬酒的離子強度為0.2 mol/L，并用強酸強堿將模擬酒溶液的pH值調(diào)至3.6，置于棕色帶蓋試劑瓶中保存。

1.2.2 不同種類花色苷對顏色的影響

稱取適量的5種基本花色苷粉末，用pH 3.6含5 g/L酒石酸、12%(體積分數(shù))乙醇水的模擬酒溶解。BOULTON[21]和CAVALCANTI等[22]認為中花色苷相對濃度達到1 mmol/L時會發(fā)生自締合作用。為了避免自締合發(fā)生，使用各花色苷濃度3.0×10-4mol/L[23]。用同樣的方法來溶解輔色素原兒茶酸，隨后將5種基本花色苷分別同原兒茶酸等體積混合，配成色素/輔色素的摩爾比為1∶40的輔色溶液于2 mL離心管中，將離心管置于生物指示器中并調(diào)節(jié)溫度20 ℃避光反應30 min后測定，以蒸餾水作為對照。

1.3 色素/輔色素摩爾比對輔色溶液顏色的影響

不同摩爾比溶液的配制：用pH 3.6含5 g/L酒石酸、12%(體積分數(shù))乙醇水的模擬酒溶解，同樣的方法來溶解花色苷和原兒茶酸，配成色素/輔色素摩爾比分別為1∶0、1∶1、1∶10、1∶20及1∶40的輔色溶液。將混合液置于2 mL離心管,在生物指示器中20 ℃下避光反應30 min后測定，以蒸餾水作為對照。

1.4 輔色效應的測定

通過比較520 nm下吸光值增加的百分比M以及最大吸收波長λmax(最大吸光值對應的波長)的偏移Δλ估計由于輔色作用產(chǎn)生的增色效應和紅移效應。其中A0為未添加輔色素的花色苷溶液在520 nm處的吸光值，A為添加了輔色素后輔色溶液在520 nm處的吸光值[24]；λ為偏移后的最大吸收波長,計算如公式(1)、(2)：

(1)

Δλ=λ-λmax

(2)

1.5 CIELab顏色評估

使用TU-1810 UV-可見分光光度計，以蒸餾水作為對照，在2 mm路徑比色皿中掃描400～700 nm的吸收光譜，掃描間隔為1 nm。在D65和10°的觀察條件下，計算CIELab顏色參數(shù)：L亮度(從0到100表示著黑色到白色的變化)，a(從負到正表示從綠色到紅色)，b(從負到正表示從藍色到黃色)，C色度(表示整體的顏色強度)以及h色調(diào)；并根據(jù)空間兩點之間的歐幾里得距離計算樣品之間的顏色差異ΔE，ΔE>3表示產(chǎn)生了人眼可以辨別的顏色變化；此外，還計算了亮度，色度和色調(diào)對總色差的相對貢獻ΔL、ΔC、ΔH[22]，如公式(3)、(4)、(5)、(6)和(7):

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理，Origin 9.0畫圖，SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間0.05下對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同結(jié)構(gòu)花色苷輔色作用的結(jié)果

2.1.1 不同結(jié)構(gòu)花色苷產(chǎn)生的增色效應和紅移效應

基本花色苷是歐亞種葡萄和葡萄酒中都含有的花色苷，也是合成其他花色苷的基礎(chǔ)物質(zhì)[25]。從化學結(jié)構(gòu)上來看，花色苷基本苷元(表1)結(jié)構(gòu)是C6-C3-C6碳架結(jié)構(gòu)的類黃酮類化合物。葡萄酒中5種基本花色苷其差異主要是B環(huán)R1和R2位取代基團的種類和數(shù)量不同(表1)。通常花色素在3位連接糖分子形成基本花色苷后其糖分子又會和一些物質(zhì)(常見的主要是一些酚類化合物)?；纬筛臃€(wěn)定的?；ㄉ誟8]。自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的花色素有23種，花色苷大約1 000種；但在葡萄酒中，基本花色苷是賦予新鮮葡萄酒色澤的主要部分[26-27]。BOULTON[28]在文獻中報道在新葡萄酒中，花色苷的顏色占了顏色值的50%～70%；HAN等分析數(shù)據(jù)表明花色苷提供了新鮮葡萄酒紅色色澤的64.56%～81.57%(CIELab,a值)[29]。

由表1和圖1可以看出，花色苷B環(huán)上R1、R2位不同取代基的種類和數(shù)量對輔色效果有著不同的影響。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OCH3)與甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(OCH3H)相比，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷B環(huán)R2位置多了一個甲氧基取代基，對應的增色效應二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷的M值分別為23.4%、18.3%，前者比后者的增色效應高了28%；紅移效應(Δλ)二者分別為3、2 nm；說明花色苷B環(huán)上R2位甲氧基取代更有利于輔色作用的進行，導致更高的輔色效果?；ù渌?3-O-葡萄糖苷(OH OH)相對于花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)而言，R2位被羥基取代，M分別為16.9%、11.1%，相同的現(xiàn)象從甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OH)、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(OCH3H)中也可以看到，2種花色苷R2位也含有不同的羥基，其M分別為23.3%、18.3%；可以看出B環(huán)上羥基的取代對輔色作用也有著積極的影響。此外，同一位置不同取代基下，被甲氧基取代的花色苷的輔色作用優(yōu)于被羥基取代的作用，比如甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OH)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(OH OH)B環(huán)上R1位置分別被甲氧基和羥基取代，其被甲氧基取代的甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷產(chǎn)生的增色效應比被羥基取代的花翠素-3-O-葡萄糖苷高出了38%；R1被甲氧基取代甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(OCH3H)比R1被羥基取代的花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)的增色效應高出了65%。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OCH3)、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OH)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(OH OH)、花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)B環(huán)上取代基取代數(shù)目不同輔色能力也不同，M分別為23.4%、23.3%、16.9%、11.1%；可以看出花色苷B環(huán)上取代基數(shù)目越多輔色效果越好。結(jié)果表明,花色苷B環(huán)上甲氧基以及羥基的取代對輔色作用都有著積極的影響，且隨著取代基數(shù)目的增加輔色能力也越強；同一位置不同取代基下被甲氧基取代的花色苷的輔色作用優(yōu)于被羥基取代的作用。

表1 葡萄酒5種基本花色苷結(jié)構(gòu)

注：Mv-3-O-Glu-二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷；Pt-3-O-Glu-甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷；Pn-3-O-Glu-甲基花青素-3-O-葡萄糖苷；Dp-3-O-Glu-花翠素-3-O-葡萄糖苷；Cy-3-O-Glu-花青素-3-O-葡萄糖苷。下同。

圖1 不同花色苷與原兒茶酸的輔色效應

Fig.1 The copigmentation of different anthocyanins and protocatechuic acid

2.1.2 不同結(jié)構(gòu)花色苷對顏色的影響

2.1.2.1 不同結(jié)構(gòu)花色苷CIELab參數(shù)評估

對于不同結(jié)構(gòu)花色苷，在未添加輔色素(1∶0)的情況下，幾種基本花色苷自身的顏色特性也不一樣，這主要由它們在520 nm下對應的吸光值A(chǔ)520和最大吸光值下吸收波長λmax不同。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(A520=0.124，λmax=523)、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(A520=0.090，λmax=524)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(A520=0.083，λmax=524)、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(A520=0.060，λmax=517)，花青素-3-O-葡萄糖苷(A520=0.190，λmax=515)；說明花色苷B環(huán)中不同取代基的種類以及不同位置的取代都對花色苷自身顏色有著本質(zhì)的影響。王宏也報道了花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷呈藍紅色，甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷呈深橙紅色[30]。所以，為了消除花色苷自身顏色的影響，計算了添加輔色素和未添加輔色素的輔色溶液之間的顏色參數(shù)差值Δa、ΔC、ΔL、Δb、Δh，來評估輔色作用引起的顏色演變。通過計算發(fā)現(xiàn)，不同結(jié)構(gòu)花色苷發(fā)生輔色作用后引起的各輔色溶液CIELab顏色參數(shù)的變化存在差異(表2)。二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OCH3)、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OH)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(OH OH)這3種花色苷B環(huán)中的甲氧基取代數(shù)目不同，顏色參數(shù)也不同，且隨著甲氧基取代數(shù)目的增加顏色參數(shù)的差異也越顯著。由表2可以看出，含有2個甲氧基的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷具有最大的紅色值、色飽和度、最高的藍色值和最低的亮度、色調(diào)值，其次是含有1個甲氧基的甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷，變化最小的為不含甲氧基的花翠素-3-O-葡萄糖苷。同時也可以看出，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷兩者之間只有Δb和Δh沒有發(fā)現(xiàn)顯著性差異，其他的顏色參數(shù)之間均存在著顯著性差異。這些結(jié)果表明，B環(huán)上的甲氧基取代越多越有助于更深的顏色(ΔL值的負向增加)，更高的紅色(Δa值增加)，更飽和的色度(ΔC值增加)，更淺的黃色和更深的藍色(Δb和Δh值降低)。這與一些學者報道的輔色素中甲氧基化影響相同，F(xiàn)ANZONE等認為簡單肉桂酸的甲氧基化反應增加了含單糖苷花色苷增色效應和花色素苷衍生物的形成[31-32]；也有學者報道甲氧基化羥基苯甲酸都顯示出對顏色增強的更高貢獻[33]。同甲氧基對顏色貢獻一樣，花色苷B環(huán)中的羥基也會提高輔色溶液的顏色，由表2可知，被2個羥基取代的花翠素-3-O-葡萄糖苷(OH OH)比被1個羥基取代的花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)擁有更低的的亮度，更高的紅色、更高的色飽和度和更淺的黃色及更深的藍色。這主要是由于輔色作用是通過花色苷和輔色素之間的π-π相互作用形成，π-π相互作用下的色散相互作用力的增強(較高的輔色極化率)有利于π-π堆積和隨后非共價復合物形成，同時B環(huán)上額外的羥基進一步通過氫鍵增強了輔色效果；也有文獻報道B環(huán)上的羥基取代導致花色苷中連接B環(huán)和C環(huán)C=C鍵的共振增加從而增加了顏色強度[17,34]。本研究中還發(fā)現(xiàn)，同一位置不同取代基對顏色的影響也不同，從本實驗中可以看出，同一位置甲氧基取代對顏色的影響優(yōu)于羥基的取代作用，表2中甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(OCH3H)、花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)R1位分別被甲氧基和羥基取代，但甲基花青素-3-O-葡萄糖苷相比于花青素-3-O-葡萄糖苷ΔL更低、顏色更深；Δa、ΔC更高，即紅色和顏色強度更強；Δb、Δh更低，說明前者較低的黃色值和較高的藍色值。

表2 五種葡萄酒基本花色苷對顏色演變的影響

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)；樣本量n=3。下同。

為了評估不同結(jié)構(gòu)的花色苷引起的顏色參數(shù)的改變是否引起視覺上可察覺的變化，計算了色差值ΔE?？梢钥吹剿谢ㄉ站斐闪巳巳庋劭刹煊X的顏色變化(ΔE>3)，發(fā)現(xiàn)除了花翠素-3-O-葡萄糖苷和甲基花青素-3-O-葡萄糖苷兩者之間色差不存在顯著性差異，其他幾種不同結(jié)構(gòu)的花色苷之間均存在著顯著性差異；二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OCH3)造成了最大的顏色差異(ΔE=7.78),分別是甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷的1.1、1.5、1.6、2.1倍。然后依次為甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(OCH3OH)(ΔE=6.91)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(OH OH)(ΔE=5.13)、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(OCH3H)(ΔE=5.00)、花青素-3-O-葡萄糖苷(OH H)(ΔE=3.68)。由此可知，不管是甲氧基取代還是羥基取代均表明,超出酚環(huán)π-共軛體系的任何延伸對輔色溶液的色澤都有積極的影響，雖然不同取代基團影響效果不同。

2.1.2.2 不同結(jié)構(gòu)花色苷顏色參數(shù)對總色差的貢獻

由圖2可知，不同結(jié)構(gòu)花色苷顏色參數(shù)對總色差的貢獻主要定量貢獻(ΔL+ΔC)為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(99.7%)、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(99.9%)、花翠素-3-O-葡萄糖苷(99.7%)、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(99.9%)、花青素-3-O-葡萄糖苷(92.7%)。這說明不同花色苷引起總色差改變的主要機制是量變造成的。這與GORDILLO等[35]報道的輔色作用引起的絕對色差主要是由于定量變化(ΔL+ΔC= 87.5%)引起的結(jié)果一致。

圖2 不同種類花色苷顏色參數(shù)對總色差的貢獻

Fig.2 Contribution of different types of anthocyanin color parameters to total color difference

2.2 不同色素/輔色素摩爾比下輔色作用的結(jié)果

2.2.1 不同摩爾比的增色效應和紅移效應

不同輔色素濃度下5種基本花色苷輔色效應如圖3和圖4所示。

圖3 不同輔色素濃度的增色效應

Fig.3 The hyperchromic effects at different copigment concentration

圖4 不同輔色素濃度的紅移效應

Fig.4 The bathochromic effects at different copigment concentration

由圖3可知，所有花色苷添加輔色素原兒茶酸后，隨著輔色素濃度的增加輔色溶液的增色效應M也增大，且在最高摩爾比時達到了最大。本實驗中，未添加輔色素的花色苷溶液在520 nm處具有最低的吸光值，當色素/輔色素摩爾比從1∶1增加到1∶40時，A520也隨之增加，分別為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷(0.124～0.153)，甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷(0.090～0.111)，花翠素-3-O-葡萄糖苷(0.083～0.097)，甲基花青素-3-O-葡萄糖苷(0.060～0.071)，花青素-3-O-葡萄糖苷(0.190～0.211)；這種隨著輔色素濃度的增加吸光值增加的現(xiàn)象說明較高的輔色素濃度產(chǎn)生了更強烈的輔色作用。這主要是由于輔色素與花色苷發(fā)生了分子間輔色作用防止了水分子的親核反應，分子間通過π-π堆積形成新的色素復合物使得吸光值發(fā)生改變。這與他人研究的色素對顏色的貢獻取決于色素和輔色素的相對濃度對有相同結(jié)果[25,35]。有圖4可知原兒茶酸的添加引起的紅移變化較小，在較低摩爾比(1∶1)時發(fā)現(xiàn)只有二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷產(chǎn)生了較小的紅移現(xiàn)象，其他幾種花色苷均未產(chǎn)生紅移現(xiàn)象；隨著摩爾比的增加，從1∶0到1∶40二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷分別僅增加了3、2、1、1、1 nm，且甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和花青素-3-O-葡萄糖苷僅在最高摩爾比時出現(xiàn)了紅移現(xiàn)象。在這種情況下，觀察到較小紅移現(xiàn)象的原因可能是輔色過程中花色苷無色半縮酮形式部分轉(zhuǎn)換回紅色黃烊陽離子，導致水合平衡的改變高于花色苷黃烊陽離子的去質(zhì)子化[31,36]；也可能由于原兒茶酸屬于羥基苯甲酸，其自身的非共軛空間構(gòu)象引起的紅移效應較小，ZHANG等[37]基于模擬解決方案中的理論計算和實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上證明了具有延伸π-共軛體系的平面結(jié)構(gòu)分子羥基肉桂酸的輔色性能普遍優(yōu)于羥基苯甲酸。

2.2.2 不同摩爾比對顏色的影響

2.2.2.1 不同摩爾比下CIELab參數(shù)評估

為了評估不同摩爾比下輔色溶液顏色的改變，計算了添加輔色素和不添加輔色素之間的CIELAB顏色參數(shù)差異，如表3所示。由表3可知，向花色苷中添加原兒茶酸導致輔色溶液與未添加輔色素溶液之間的ΔL、Δa、ΔC均存在顯著性差異，且隨著輔色素濃度的增加差異越顯著。當色素/輔色素摩爾比由1∶1增加到1∶40時，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷ΔL從-0.53到-4.23，甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷從-0.09到-3.54，花翠素-3-O-葡萄糖苷從-0.59到-2.35，甲基花青素-3-O-葡萄糖苷從-0.37到-2.03，花青素-3-O-葡萄糖苷從-0.53到-1.55；ΔL的負向增大說明輔色素的添加導致溶液亮度更低、顏色更深，輔色素添加量越高這種效果越明顯。與ΔL變化相反，Δa和ΔC隨著輔色素濃度的增加正向增大且各摩爾比之間也均存在著顯著性差異，其中Δa的增加說明輔色素的添加使得溶液的紅色更強、而更高的ΔC說明溶液顏色的飽和度更好。因此，輔色作用與花色苷溶液的變暗、更強烈的顏色和視覺飽和度相關(guān)，表明輔色素的添加誘導了更高的整體顏色強度，這些變化隨著輔色素濃度的增加更加顯著，與GONZLEZMA-NZANO等[24]、GORDILLO等[35]使用其他輔助因子的研究結(jié)果一致。不同的是，二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-葡萄糖苷摩爾比從1∶1到1∶40時顏色參數(shù)Δb、Δh降低，說明輔色溶液的顏色向藍紫色轉(zhuǎn)變；相反，甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷的輔色溶液中觀察到輔色素濃度的增加誘導溶液顏色向紅橙色轉(zhuǎn)變(Δb、Δh升高)。為了評估輔色素濃度增加引起的顏色參數(shù)改變是否引起視覺上可察覺的變化，計算色差值ΔE。GARCA-AROMP等[38]認為當ΔE>3時，人眼就能夠區(qū)分2種顏色的差異。由表3可以看出,輔色素的添加使得各摩爾比下ΔE均表現(xiàn)出了顯著性差異，但在1∶1和1∶10 摩爾比下所有花色苷輔色溶液均未產(chǎn)生人眼能察覺的色差變化(ΔE<3)，隨著摩爾比的增加，在摩爾比1∶20時二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷產(chǎn)生視覺可覺察的顏色演變(ΔE分別為3.99、3.48)，在1∶40時所有花色苷溶液均表現(xiàn)出了人肉眼可辨別的顏色變化(ΔE>3)[33]。這主要是因為隨著輔色素濃度的增加，誘導了輔色素與黃烊陽離子的優(yōu)先結(jié)合，花色苷水合平衡向著有色形式轉(zhuǎn)移[6]。

表3 不同輔色素濃度下5種基本花色苷顏色參數(shù)評估

2.2.2.2 不同摩爾比下顏色參數(shù)對總色差的貢獻

比較了5種基本花色苷在各摩爾比下獲得的亮度，色度和色調(diào)對總色差的相對貢獻(ΔL、ΔC、ΔH)。由圖5可知，模擬酒中不同花色苷不同摩爾比下，對總色差的貢獻主要也是定量變化(ΔL+ΔC>80%)，其中僅有較小部分是由于定性變化引起的(ΔH<20%)。同時也可得知，在較低的摩爾比下定量變化中主要貢獻是亮度引起的(ΔL>ΔC)，隨著輔色素濃度增加定量貢獻模式發(fā)生演變使得色度的貢獻>亮度的貢獻(ΔL<ΔC)。在給定的摩爾比下，受到花色苷結(jié)構(gòu)不同的影響，色調(diào)(ΔH)貢獻的大小通常具有可變性，沒有明顯的趨勢。

a-Mv-3-O-Glu;b-Pt-3-O-Glu;c-Dp-3-O-Glu;d-Pn-3-O-Glu;f-Cy-3-O-Glu

圖5 不同輔色素濃度下顏色參數(shù)對總色差的貢獻

Fig.5 Contribution of color parameters to total color difference at different copiment concentration

2.3 不同摩爾比下5種花色苷與原兒茶酸對顏色演變的熱圖分析

將5種花色苷與原兒茶酸在不同摩爾比下對顏色的影響進行分析，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同摩爾比下5種花色苷與原兒茶酸對顏色演變影響的熱圖分析

Fig.6 Heat map analysis of the effects of five anthocyanins and protocatechuic acid on color evolution at different molar ratios

注：L=ΔL值; a= Δa值; b=Δb值; c= ΔC值; H= Δh值; E=ΔE值。

按照橫向聚類分析，可以分為2類，ΔE、Δa、ΔC這幾個顏色參數(shù)可以聚為第一類，主要呈現(xiàn)出較深的黑灰色色帶，幾個顏色參數(shù)與顏色的演變成正向關(guān)系；隨著輔色素濃度的增加色帶顏色也加深，在摩爾比1∶40時,ΔE、Δa、ΔC展現(xiàn)出最深的色帶，說明輔色素濃度越高花色苷溶液的顏色整體強度越好。第二類是Δb、Δh、ΔL，這一類的色帶主要以灰白為主，從圖中可以看出顏色參數(shù)與顏色的變化成負向相關(guān)，ΔL在1∶40色帶最淺。色帶越淺說明ΔL值越小，花色苷溶液顏色越暗。

按照縱向聚類分析，可以將5種花色苷分為3類，第1類中包含1個花色苷，即Cy-3-O-Glu，該花色苷有著較低的Δa、ΔC值，是幾種花色苷中輔色效應最小的。第2類包含Dp-3-O-Glu和Pt-3-O-Glu，這2種花色苷的Δa、ΔC值較高，其Δb值呈現(xiàn)負相關(guān)，表現(xiàn)出藍色值。第3類包含Mv-3-O-Glu和Pn-3-O-Glu，這2種花色苷顏色參數(shù)的色帶漸變趨勢最為相似。

綜合來看，使用CIELAB色度空間分析結(jié)合熱圖分析，可以更直觀和形象地表征輔色溶液的顏色特征，為相關(guān)顏色特征研究提供基礎(chǔ)的分析方法。

3 結(jié)論

在本研究中，輔色溶液的顏色受到色素與輔色素的摩爾比和花色苷B環(huán)中取代基的種類和數(shù)量的影響。研究結(jié)果表明，花色苷B環(huán)上甲氧基和羥基取代使得花色苷酚環(huán)π-共軛體系額外延伸對輔色溶液的色澤有著積極的影響；甲氧基和羥基取代數(shù)目越多越有助于更暗的顏色、更高的紅色、更飽和以及更亮的色度，且R1位置被甲氧基取代的輔色效果優(yōu)于羥基取代效果。輔色素濃度的增加導致了更大的增色效應，使得輔色溶液的顏色更深、紅色和色飽和度更高。隨著輔色素濃度的增加輔色效果越明顯，色差也越大，在摩爾比1∶40時所有花色苷輔色溶液均造成了視覺可察覺的顏色變化且各花色苷之間存在著顯著性差異。此外，通過計算顏色參數(shù)對總色差的相對貢獻，發(fā)現(xiàn)輔色溶液總色差的改變主要是量變引起的。