李文，陳銀元，陳立明，郭祥，袁珍虎，王陶*

1(徐州工程學(xué)院，江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州，221008) 2(徐州正昌飼料有限公司，江蘇 徐州，221008)

益生菌是一種能夠黏附在宿主體內(nèi)來增強(qiáng)宿主免疫能力，或通過促進(jìn)宿主腸道的營養(yǎng)組成與控制體內(nèi)多種菌的動(dòng)態(tài)平衡，來提高宿主健康程度的活性微生物[1]。常見的益生菌有枯草桿菌、乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌等。用于發(fā)酵的益生菌多以乳酸菌為主，其作為食品發(fā)酵劑已有很長使用歷史，被普遍認(rèn)為安全性較高[2-3]，具有多種生理功能，如控制腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)、免疫調(diào)節(jié)、抑制病原菌、抗過敏、抗腫瘤、延緩衰老等[4-7]。乳酸菌若想順利到達(dá)體內(nèi)并發(fā)揮作用，一方面，要具備對胃腸道內(nèi)酸和膽鹽的耐受能力[8]；另一方面，要能夠黏附于宿主的腸壁細(xì)胞，以保證其能抵抗住腸道的蠕動(dòng)作用[9]；此外，還必須具備對常見致病菌的抑制能力以及對膽固醇和甘油三酯的降解能力等[10]。目前對于乳酸菌益生特性的研究，多集中于植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、戊糖乳桿菌等[11-13]，鮮有魏斯氏菌益生特性的報(bào)道，而不同益生菌株在益生特性方面存在著高度的特異性[14]。

魏斯氏菌屬于乳酸菌，廣泛分布于發(fā)酵食物如臘腸、泡菜、醬油、豆豉等, 多數(shù)菌種在食品發(fā)酵過程中起重要作用，對食品中酯類、有機(jī)酸及短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的合成具有重要作用。此外，其還具有合成細(xì)菌素、胞外多糖等特性，具有潛在的益生菌特性[15]。因此，本研究以分離自泡菜的2株魏斯氏菌——希臘魏斯菌(WeissellaHellenica)WS-419和綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)ZY-6為對象，對其益生特性如耐酸性、耐膽鹽、腸液耐受性、抑菌特性、降解膽固醇和甘油三酯、表面特性進(jìn)行比較研究，為進(jìn)一步應(yīng)用此2株菌進(jìn)行功能性食品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 材料與試劑

希臘魏斯菌(WeissellaHellenica)WS-419、綠色魏斯菌(Weissellaviridescens)ZY-6、沙門氏菌(Salmonella)SM-5、大腸桿菌(Escherichiacoli)EC-19、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)SA-405，徐州工程學(xué)院微生物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室保存。

甘油三酯、膽固醇測定試劑盒，長春匯力生物技術(shù)有限公司。

膽固醇、豬膽鹽、檸檬酸銨、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、葡萄糖、無水乙酸鈉、吐溫-80、正己烷、蔗糖酯等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 LB液體培養(yǎng)基(g/L)

酵母浸膏5，胰蛋白胨10， NaCl 10，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 LB固體培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.3 LB半固體培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基中加入7.5 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.4 MRS液體培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖20、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏15、檸檬酸銨2、無水乙酸鈉5、MnSO4·H2O 0.198 g/L、K2HPO4·3H2O 2.62、MgSO4·7H2O 0.58、吐溫-80體積分?jǐn)?shù)0.1%，pH 6.0～6.5，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.5 MRS固體培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉。

1.1.2.6 甘油三酯(TG)培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)1%的豬油和體積分?jǐn)?shù)5%的吐溫-80、質(zhì)量濃度2 g/L巰基乙酸鈉， pH值6.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.2.7 膽固醇(TC)培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量濃度0.1 g/L膽固醇、體積分?jǐn)?shù)0.5%冰乙酸、體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80、質(zhì)量濃度2 g/L巰基乙酸鈉、質(zhì)量濃度0.1 g/L蔗糖酯， pH 6.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

HYG-Ⅱ回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-IF超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FA2104N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；64RL高速冷凍離心機(jī)，美國Beckman公司；DHG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀SynergyHI ，美國Biotek 公司；722型分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液的制備

將保藏于甘油管的希臘魏斯菌WS-419和綠色魏斯菌ZY-6接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，再以4%的接種量接種至新鮮MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)16～18 h至對數(shù)生長期，得種子液。

1.2.2 耐酸性測定

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入pH值分別為2、3、4的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別于0、1、2和3 h從中吸取菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照公式(1)計(jì)算存活率[16]:

(1)

式中：Nt,各時(shí)間段的活菌數(shù)，CFU/mL；N0,0 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.3 膽鹽耐受性

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入膽鹽濃度分別為0.3、1.5、3 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)，分別于0、1、2、3 h從中吸取菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照1.2.2中的公式計(jì)算存活率。

1.2.4 腸液耐受性

1.2.4.1 人工腸液的制備

0.18 g膽鹽、0.1 g胰蛋白酶、溶于無菌溶劑(1.1 g NaHCO3、0.2 g NaCl及100 mL蒸餾水)，用0.5 mol/L的NaOH調(diào)整pH值到7.0[17]。溶液過0.22 μm微孔濾膜除菌。

1.2.4.2 腸液耐受性的測定

將2株魏斯菌種子液按4%的接種量接入人工腸液中，放37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別于0、1、2、3 h從中吸取菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋，涂布至MRS固體培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)30～300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。按照1.2.2中的公式計(jì)算存活率。

1.2.5 抑菌特性

1.2.5.1 指示菌種子液的制備

將沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，置37 ℃，120 r/min的搖床振蕩培養(yǎng)12～16 h至對數(shù)生長期，備用。

1.2.5.2 樣品的制備

將2株魏斯菌的發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，得到發(fā)酵上清液，按如下方式制備樣品：(a)用6 mol/L NaOH將發(fā)酵上清液調(diào)至pH值6.5；(b)發(fā)酵上清液；(c)空白培養(yǎng)基，用乳酸調(diào)至pH值與發(fā)酵上清液相同；(d)空白培養(yǎng)基。上述4種樣品均通過無菌過濾膜(0.22 μm)除菌，備用。

1.2.5.3 抑菌活性的測定

用LB半固體培養(yǎng)基將3種指示菌種子液稀釋至菌數(shù)為106～107CFU/mL，倒平板。待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子將滅菌的牛津杯置于瓊脂表面，在牛津杯中注入200 μL上述4種樣品，放于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)過夜后，取出觀察，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑的大小[16]。

1.2.6 菌株對膽固醇和甘油三酯的降解特性

1.2.6.1 對膽固醇的降解特性

將2株魏斯菌接種至膽固醇培養(yǎng)基，于37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，取上清，分別測定0 h和48 h發(fā)酵上清中的膽固醇濃度，按公式(2)計(jì)算膽固醇降解率[18]。

(2)

式中：C0，0 h發(fā)酵上清中的膽固醇濃度，mmoL/L；C48，48 h發(fā)酵上清中的膽固醇濃度，mmoL/L。

1.2.6.2 對甘油三酯的降解特性

將2株魏斯菌接種至甘油三酯培養(yǎng)基，于37 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，取上清，分別測定0 h和48 h發(fā)酵上清中的甘油三酯濃度，按公式(3)計(jì)算甘油三酯的降解率[19]。

(3)

式中：A0，0 h發(fā)酵上清中的甘油三酯濃度，mmoL/L；A48，48 h發(fā)酵上清中的甘油三酯濃度，mmoL/L。

1.2.7 菌株表面特性

1.2.7.1 表面疏水性的測定

采用碳烴化合物法(MATH)[20]。分別取2株菌的菌懸液離心(8 000 r/min，10 min)，棄上清，用磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.0)洗滌菌體2次后使菌重懸，調(diào)整菌懸液的OD600為0.8。在試管內(nèi)加入4 mL菌液、1 mL正己烷，對照組不加正己烷，封口，用旋渦振蕩儀劇烈振蕩60 s，靜置15 min分層。吸取下相水溶液3.0 mL，以Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液為空白對照，在600 nm波長下測定吸光度，細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性(cell-surface hydrophobicity, CSH)按公式(3)計(jì)算:

(3)

式中：A0，對照組光密度值；AS，實(shí)驗(yàn)組光密度值。

1.2.7.2 表面凝集性

取5 mL按1.2.7.1所述方法調(diào)整好菌濃的菌懸液，于37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)2 h后，輕輕吸取200 μL上層懸浮液，不搖動(dòng)，測定其在600 nm波長處的光密度值，菌體凝集性按公式(4)計(jì)算[21]：

(4)

式中：OD0，菌懸液初始光密度值；ODt，菌懸液靜置后光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(x±s)表示，采用Spss 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s ANOVA進(jìn)行多重比較，不同處理組之間P<0.05表示差異性顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐酸性能

測定酸性條件下對2株菌存活的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 pH值對WS-419(A)和ZY-6(B)存活率的影響

Fig.1 Effect of pH value on survival rate of WS-419(A) and ZY-6(B)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

可以看出，當(dāng)pH為2時(shí)，隨時(shí)間的延長，2株菌的存活率皆出現(xiàn)了一定程度的下降(P<0.05)，3 h后WS-419和ZY-6的存活率分別為24.65%和45.18%；當(dāng)pH升高時(shí)，隨時(shí)間的延長，2株菌的存活率都出現(xiàn)了增大的情況(P<0.05)，當(dāng)pH為3時(shí)，WS-419和ZY-6在3h后的存活率分別為115.73%和118.58%；pH為4時(shí)，3 h后的存活率分別123.31%和133.18%，這可能是由于菌株的耐受性較好，當(dāng)pH值較低時(shí)，并不能抑制其生長，而是出現(xiàn)了在培養(yǎng)基中隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌體生長的現(xiàn)象。劉秀俠等在研究枯草芽孢桿菌的益生特性時(shí)，也有類

似發(fā)現(xiàn)[22]?？傮w看來，2株菌對酸性條件皆有一定的耐性，ZY-6的耐酸性稍強(qiáng)于WS-419，體現(xiàn)在同一pH條件下，ZY-6的存活率都高于WS-419(P<0.05)。

2.2 膽鹽耐受性

膽鹽會對微生物的生長產(chǎn)生一定的抑制作用[23]。正常情況下小腸內(nèi)膽鹽質(zhì)量濃度在 0.3～3.0 g/L[24]，因此，選擇0.3、1.5和3.0 g/L 3個(gè)濃度來考察菌株的膽鹽耐受性，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，2株菌在低、中、高濃度的膽鹽中，隨時(shí)間的延長，存活率皆有所下降(P<0.05)，但呈現(xiàn)出了一定的耐膽鹽特性。當(dāng)膽鹽質(zhì)量濃度為0.3 g/L時(shí)，3 h后，2株菌的存活率皆保持在90%左右；隨膽鹽濃度的升高，存活率出現(xiàn)了下降的情況，但在高膽鹽質(zhì)量濃度下，WS-419和ZY-6在3 h后的存活率也較高，分別為72.05%和75.89%?？傮w說來，ZY-6和WS-419的膽鹽耐受性無明顯差異(P>0.05)。

圖2 膽鹽濃度對WS-419(A)和ZY-6(B)存活率的影響

Fig.2 Effect of concentrations of bile salt on survival rate of WS-419 (A) and ZY-6 (B)

2.3 耐人工腸液性能

考察2株菌在人工腸液中的存活情況，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨時(shí)間的延長，2株菌在人工腸液中的存活率出現(xiàn)了下降(P<0.05)，WS-419在2 h之前的存活率都保持在90%以上，3 h后的存活率降為85.47%；ZY-6的存活率在1 h后降為86.72%，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長，存活率變化不顯著(P>0.05)。因此，2株菌均表現(xiàn)出了對人工腸液的較好抗性。

圖3 人工腸液測定

Fig.3 Determination of tolerance to simulated intestinal fluid

2.4 抑菌特性

益生菌可以作為腸道的保護(hù)屏障，抑制腸道病原菌，保持腸道微生態(tài)平衡[25]。選取3種常見的腸道致病菌：沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，考察2株魏斯菌對3種致病菌在平板上生長的抑制作用，并測定其抑菌圈直徑大小，結(jié)果見圖4和圖5。

A、C、E分別為WS-419對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用；B、D、F分別為ZY-6對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用；a-調(diào)中性的發(fā)酵上清；b-發(fā)酵上清液；c-調(diào)酸的空白培養(yǎng)基；d-空白培養(yǎng)基

圖4 兩株菌對指示菌的抑制作用

Fig.4 Inhibitory activities of the two strains against various pathogens

圖5 WS-419 (A)和ZY-6 (B)對指示菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑

Fig.5 Diameter of inhibition zone of WS-419 (A)and ZY-6 (B) against various pathogens

可以看出，2株菌的發(fā)酵上清液對3種指示菌的生長皆呈現(xiàn)出了較好的抑制作用，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制作用表現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的趨勢。WS-419發(fā)酵上清液對3種指示菌的抑菌圈直徑分別為(22.59±1.49)、 (25.82±0.20)、(27.96±0.04)mm；ZY-6分別為(22.61±0.90)、(27.02±0.53)、(30.53±1.40)mm。ZY-6對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果好于WS-419(P<0.05)；對于每種指示菌而言，發(fā)酵上清液的抑菌效果好于調(diào)酸的空白培養(yǎng)基(P<0.05)，可見，發(fā)酵過程中，除了產(chǎn)生有機(jī)酸如乳酸等使發(fā)酵液呈現(xiàn)酸性，對菌的生長產(chǎn)生酸抑制外，也會產(chǎn)生一些抑菌活性物質(zhì)如細(xì)菌素等，與酸共同作用，從而呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抑菌作用；調(diào)成中性的發(fā)酵上清液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出了較弱的抑菌效果，而空白培養(yǎng)基對3種指示菌皆無抑菌作用，這進(jìn)一步驗(yàn)證了發(fā)酵上清中存在抑菌活性物質(zhì)，但具有一定的菌種選擇性。

2.5 降解甘油三酯和膽固醇特性

血清中膽固醇、甘油三酯含量過高，會誘發(fā)冠心病、腦中風(fēng)、高血壓等心腦血管疾病，嚴(yán)重影響健康。因此，菌株對膽固醇、甘油三酯的降解能力是衡量益生菌益生特性的指標(biāo)之一。由圖6可以看出，在分別含膽固醇和甘油三酯的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，WS-419和ZY-6對膽固醇的降解率相似(P>0.05)，分別為32.79%和32.13%；對甘油三酯的降解率分別為42.80%和26.70%，WS-419對甘油三酯的降解能力強(qiáng)于ZY-6(P<0.05)。

圖6 菌株對膽固醇和甘油三酯的降解作用

Fig.6 Degradation of cholesterol and triglyceride by strains

2.6 表面特性

菌株的表面特性決定了菌株能否較好地黏附并定殖于消化道，以發(fā)揮其益生功效。測定2株菌的表面疏水性和表面凝集性，結(jié)果見表1。WS-419和ZY-6的表面疏水性分別為60.24%和61.41%，表面凝集性分別為67.30%和68.65%，2株菌具有相似的較好的表面特性(P>0.05)，因此，都具備黏附在腸道上皮細(xì)胞和黏膜表面上，以發(fā)揮其益生功效的能力。

表1 菌株的表面疏水性和表面凝集性 單位：%

注：同列數(shù)據(jù)中的不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論

綠色魏斯菌ZY-6和希臘魏斯菌WS-419是分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品泡菜中的2株乳酸菌，本文對其益生特性進(jìn)行了比較研究：耐酸性和抑菌特性方面，綠色魏斯菌ZY-6更優(yōu)，其在pH為2時(shí)，3 h后的存活率為45.18%，高于WS-419的24.65%；pH為3和4時(shí)，存活率分別為118.58%和133.18%。對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的抑菌圈直徑分別為22.61、27.02、30.53 mm，好于WS-419的22.59、 25.82、27.96 mm，這種抑制作用除來源于酸外，可能還和抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)。在降解膽固醇時(shí)，WS-419體現(xiàn)出更好的降解特性，降解率為42.80%，高于ZY-6的26.70%。ZY-6和WS-419益生特性大多相似：都具備較好的膽鹽耐受性，在3 g/L的膽鹽濃度中存活率分別為75.89%和72.05%；對人工腸液具有一定的抗性，3 h后的存活率維持在80%左右；2種菌具備降解膽固醇能力，降解率分別為32.79%和32.13%；表面疏水性分別為61.41%、60.24%；表面凝集性分別為68.65%、67.30%，皆顯示出較好的表面特性。2株魏斯菌呈現(xiàn)出的良好的益生特性表明，它們能夠克服體內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮其正常的益生作用，具備進(jìn)行功能性食品開發(fā)的潛力。

綠色魏斯菌ZY-6和希臘魏斯菌WS-419同屬于魏斯氏菌屬，在某些益生特性如耐膽鹽、耐人工腸液、降膽固醇、表面特性方面表現(xiàn)出一定的相似性，但在耐酸性、抑菌特性、降甘油三酯方面又呈現(xiàn)出一定的差異，這可能是由于其分屬不同的種所致，后續(xù)可以深入探討其機(jī)制，從而為益生菌益生特性的研究提供理論依據(jù)。