闞寶軍，董晉軍，劉暉，占米林，許國超，韓瑞枝，倪曄*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，生物催化與酶工程研究室，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

L-鳥氨酸(L-Ornithine)和L-精氨酸(L-Arginine)作為尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，具有多種重要的生理生化功能，在食品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1]。L-精氨酸是合成肌酸、蛋白質(zhì)的重要原料，是體內(nèi)信號分子NO的唯一前體，可用于治療心絞痛、神經(jīng)性疾病和肝硬化等[2]。L-鳥氨酸有益于創(chuàng)傷、燒傷、感染甚至癌癥等疾病的恢復(fù)，對肝病也有治療作用[3-4]，還具有良好的減肥保健作用[5]。L-精氨酸的生產(chǎn)方法主要有毛發(fā)水解液提取和微生物發(fā)酵法。目前，L-鳥氨酸可以通過精氨酸酶水解L-精氨酸和微生物好氧發(fā)酵2種方法來生產(chǎn)[6]。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種環(huán)境友好的非致病性革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，已廣泛應(yīng)用于多種有機酸和氨基酸的工業(yè)生產(chǎn)[7]。在谷氨酸棒桿菌中，合成氨基酸通常需要消耗大量的NADPH。在L-精氨酸合成途徑中每生產(chǎn)1 molL-精氨酸，需要消耗3 mol的NADPH[8]，對于L-鳥氨酸的合成，至少需要消耗2 mol NADPH才能合成1 molL-鳥氨酸[9]，因此，胞內(nèi)NADPH的供給被認(rèn)為是L-精氨酸及L-鳥氨酸合成的限制因素。

TAKENO等[10]用變異鏈球菌來源的NADP+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)替代內(nèi)源性NAD+依賴型甘油醛-3-磷酸脫氫酶，來改善谷氨酸棒桿菌NADPH水平和提高L-賴氨酸產(chǎn)量。郭雯等[11]通過加強胞內(nèi)NAD+依賴型的GAPDH表達(dá)，L-絲氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強度均提高了17.4%[11]，說明GAPDH是谷氨酸棒桿菌中的限速酶，通過增加該酶的表達(dá)可以增強糖酵解途徑代謝流。

谷氨酸棒狀桿菌SNK118(C.glutamicumSNK118)是本實驗室構(gòu)建的L-精氨酸生產(chǎn)菌株[12]。如圖1所示，在谷氨酸棒桿菌中，L-谷氨酸可以通過由ArgC、ArgJ、ArgB和ArgD組成的代謝途徑生成L-鳥氨酸，再由ArgF、ArgG和ArgH 3個酶催化生成L-精氨酸。采用CRISPR-Cpf1技術(shù)[13]敲除argF基因以積累L-鳥氨酸，通過敲除argR(精氨酸操縱子阻遏蛋白基因[14])可增加L-鳥氨酸產(chǎn)量。本研究擬在谷氨酸棒桿菌中重組表達(dá)梭菌來源的NADP+依賴型的GAPDH編碼基因，以增加糖酵解途徑代謝流，同時提高胞內(nèi)NADPH含量，提高L-精氨酸以及L-鳥氨酸的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及引物

本研究中所涉及到的菌株與質(zhì)粒和引物及其相關(guān)性質(zhì)等描述見表1和表2。

表1 本文所用的菌株與質(zhì)粒

表2 本研究所用的引物

1.1.2 試劑

非連接酶依賴型單片段快速一步克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司；Gibson無縫連接試劑盒，NEB公司；DL-三磷酸甘油醛，Sigma-Aldrich公司；限制性核酸內(nèi)切酶、Primer STAR DNA聚合酶，Takara寶生物工程有限公司；其他試劑，國藥集團(上海)化學(xué)試劑，有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

(1)谷氨酸棒桿菌活化用BHI培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，蛋白胨10，腦心浸液18.5，酵母粉5，pH值調(diào)至7.2～7.4。固體培養(yǎng)基添加17的瓊脂粉，115 ℃滅菌20 min。

(2)谷氨酸棒狀桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備用EPO培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉 5，NaCl 10，甘氨酸 25，吐溫-80 1，異煙肼 0.4，腦心浸液18.5，121 ℃滅菌20 min。

(3)谷氨酸棒狀桿菌電轉(zhuǎn)恢復(fù)用LB-HIS培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 5，蛋白胨20，腦心浸液18.5，酵母粉10，D-山梨醇91，pH值調(diào)至7.2～7.4。固體培養(yǎng)基添加17 g/L的瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

(4)種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L(115 ℃滅菌16 min，分消)，生物素 50 μg/L(濾膜過濾除菌)，玉米漿干粉25 g/L，(NH4)2SO45 g/L，尿素 0.8 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，pH值調(diào)至7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。

(5)發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO41.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，尿素0.75 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，玉米漿干粉20 g/L，(NH4)2SO440 g/L，MnSO4·H2O 22.38 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 18.3 mg/L，pH調(diào)至7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min；葡萄糖100 g/L(115 ℃滅菌15 min，分消)，CaCO330 g/L(160 ℃干熱滅菌1.5～2 h)，生物素 100 μg/L，維生素B1200 μg/L。裝液量30 mL/500 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究共克隆了3個GAPDH編碼基因：CagapC、CbgapC和CsgapC，分別來源于梭菌C.beijerinckiiDSM 1739、C.acetobutylicum1.7和C.saccharobutylicumDSM 13864。以構(gòu)建pXMJ19-CsgapC的方法為例，首先以pXMJ19為載體質(zhì)粒，選取HindIII和XbaI雙酶切質(zhì)粒使其線性化，將酶切產(chǎn)物純化回收。同時以ClostridiumsaccharobutylicumDSM 13864基因組為模板，以CsgapC-F/CsgapC-R為引物，PCR擴增得到CsgapC片段，其中片段兩端帶有質(zhì)粒的同源臂片段，凝膠電泳驗證并通過膠回收試劑盒純化。將純化好的CsgapC片段與pXMJ19片段通過快速一步克隆試劑盒連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，通過pXMJ19多克隆位點上下游序列設(shè)計的通用引物pXMJ19-F/pXMJ19-R進行菌落PCR，驗證并提取質(zhì)粒測序確認(rèn)。質(zhì)粒pXMJ19-CbgapC和pXMJ19-CagapC的構(gòu)建參考本方法。重組質(zhì)粒pXMJ19-CsgapC構(gòu)建流程見圖1、圖2。

圖1 谷氨酸棒桿菌中L-鳥氨酸和L-精氨酸的合成途徑

Fig.1 The biosynthesis pathway of L-ornithine and L-arginine in C. glutamicum

圖2 pXMJ19-CsgapC質(zhì)粒構(gòu)建

Fig.2 Construction of pXMJ19-CsgapC plasmid

1.2.2 CRISPR-Cpf1系統(tǒng)基因敲除質(zhì)粒pJYS3_ΔargFΔargR的構(gòu)建

基因argF和argR在谷氨酸棒狀桿菌基因組上的位置相距48 bp。首先以質(zhì)粒pJYS3_ΔcrtYf作為模板，通過引物crRNA_argFR-F/crRNA_argFR-F引入定點突變，即通過全質(zhì)粒PCR反應(yīng)將crtYf基因的crRNA序列(GAATTTCTACTGTTGTAGATCAGGCAACCA-TAGGGCAGGAA)替換為argF基因的crRNA序列(GAATTTCTACTGTTGTAGATGTCCC-TCGAGTGGACGCTCCG)。DpnI消化掉PCR產(chǎn)物中的母本質(zhì)粒，消化液轉(zhuǎn)入克隆宿主E.coliJM109。測序驗證正確后獲得pJYS3-I質(zhì)粒。然后，以pJYS3-F/pJYS3-R為引物，pJYS3-I為模板，PCR擴增得到不包含crtYf基因上下游同源臂的pJYS3-H片段。同時以C.glutamicumSNK118基因組為模板，分別以引物argFR-D-F/argFR-D-R與argFR-U-F/argFR-U-R擴增出基因的下游D與上游U同源片段。膠回收純化以上3個目的片段，通過Gibson組裝法[16]將這3個片段進行組裝連接。構(gòu)建成功獲得質(zhì)粒pJYS3_ΔargFΔargR。質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖3所示。

圖3 敲除質(zhì)粒pJYS3_ΔargFΔargR的構(gòu)建

Fig.3 Construction of knockout plasmid pJYS3_ΔargFΔargR

1.2.3 異源基因表達(dá)重組菌株的構(gòu)建

(1)重組大腸桿菌的構(gòu)建

參考SAMBROOK的方法[17]，將構(gòu)建成功的異源基因重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主表達(dá)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中，并涂布于30 mg/L氯霉素平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h后菌落PCR驗證。

(2)重組谷氨酸棒狀桿菌的構(gòu)建

將上述初篩到的2種重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到C.glutamicum感受態(tài)細(xì)胞中，獲得4株重組谷氨酸棒狀桿菌菌株SNK118/pXMJ19-CagapC、SNK118/pXMJ19-CsgapC、SNK118 ΔargFΔargR/pXMJ19-CagapC、SNK118ΔargFΔargR/pXMJ19-CsgapC。谷氨酸棒桿菌電轉(zhuǎn)方法與感受態(tài)制備見REST的方法[18]。

1.2.4 基因敲除菌SNK118ΔargRΔargF的構(gòu)建

將成功構(gòu)建的基因敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至C.glutamicumSNK118感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于含卡那霉素平板，30 ℃靜置培養(yǎng)3～4 d，培養(yǎng)過程中Cpf1會對crRNA進行加工，成熟的crRNA會引導(dǎo)Cpf1結(jié)合到DNA的特異性位點上,對目標(biāo)基因進行切割，在菌體內(nèi)重組酶的作用下，通過同源重組將基因argF、argR進行敲除，培養(yǎng)結(jié)束后菌落PCR驗證篩選出成功敲除的突變株。對成功敲除的突變株劃線于無抗平板，34 ℃培養(yǎng)16 h以消除pJYS3_ΔargFΔargR。

1.2.5 GAPDH酶活力的測定

在30 ℃條件下，通過分光光度法測量340 nm波長下NADP(或NAD+)還原的吸光值變化來計算GAPDH活力[19]。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有300 μL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)，60 μL 10 mmol/L H3PO4，60 μL 10 mmol/L NADP+(或NAD+)，60 μL 10 mmol/L甘油醛3-磷酸，50 μL的β-巰基乙醇和70 μL粗酶液。通過添加細(xì)胞破碎粗酶液引發(fā)催化反應(yīng)。1單位GAPDH活力定義為在上述條件下1 min內(nèi)還原1 μmol NAD(或NADP+)所需的酶量。

使用牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液，通過Bradford方法計算蛋白質(zhì)濃度,按公式(1)計算：

(1)

1.2.6 胞內(nèi)輔酶水平的測定

30 ℃培養(yǎng)46 h后收獲菌體細(xì)胞，并洗滌2次。使用NADP+/NADPH試劑盒(BioAssay Systems，Hayward，CA)抽提并測定胞內(nèi)NADPH/NADP+的輔酶參數(shù)。

1.2.7 菌體濃度、氨基酸濃度、葡萄糖濃度的測定

菌體濃度的測定：取一定量的菌液用0.2 mol/L鹽酸稀釋50～100倍后，用分光光度計在660 nm波長下測定吸光值。

氨基酸濃度測定：采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)分析儀進行鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)在線衍生化法測定[20]。

葡萄糖濃度的測定：發(fā)酵上清液稀釋100倍，采用SBA-40C生物傳感器分析儀進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 NADP+依賴型的GAPDH的克隆與表達(dá)篩選

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，通過BLAST搜索，選擇不同梭菌的3個編碼NADP+依賴型的GAPDH基因：CagapC、CbgapC、CsgapC。將這3個基因克隆到穿梭載體pXMJ19中，并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。之后測定細(xì)胞提取物中重組GAPDH的比活力，如表3所示。

表3 重組GAPDH在E. coli和C. glutamicum的酶活力

結(jié)果顯示,重組CaGapC和CsGapC在30 ℃下的比活力分別為2 000 mU/mg和5 263 mU/mg，而CbGapC沒有顯示出催化活性?；谝陨辖Y(jié)果，將重組質(zhì)粒pXMJ19-CagapC、pXMJ19-CsgapC分別轉(zhuǎn)入SNK118菌株，評估這2個重組酶在谷氨酸棒桿菌中合成NADPH的催化活性。據(jù)報道，丙酮丁醇梭菌來源的編碼NADP+依賴型GAPDH的gapC的表達(dá)改善了谷氨酸棒桿菌胞內(nèi)NADPH的供應(yīng)[21]。然而，在甘油醛-3-磷酸和NADP+作為底物時，只有CsGapC顯示出77 mU/mg的酶活力(表3)，表明CsGapC具有催化3-磷酸甘油醛生成3-磷酸甘油酸的活性，同時可以為C.glutamicumSNK118提供額外的NADPH來源。

2.2 重組菌發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸性能評價

將重組菌LA4(SNK118/pXMJ19-CsgapC)與對照菌LA1(SNK118/pXMJ19)的種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，考察CsgapC的重組表達(dá)對谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-精氨酸的影響。結(jié)果如圖4所示，發(fā)酵過程中菌濃并無明顯差異。在40 h時重組菌LA4的L-精氨酸濃度超過對照菌LA1；最終發(fā)酵至70 h，LA4的L-精氨酸產(chǎn)量為11.55 g/L，較LA1(9.17 g/L)對照菌株L-精氨酸產(chǎn)量提高了26%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了10%(見表4)，說明CsgapC的表達(dá)能有效提高谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-精氨酸的能力。同時，通過測定對數(shù)生長期時胞內(nèi)NADPH/NADP+參數(shù)，發(fā)現(xiàn)重組菌LA4中的NADPH/NADP+比值為0.31，顯著高于對照菌LA1(0.21)，說明重組菌LA4的胞內(nèi)NADPH水平得到了提高。KABUS等[22]和ZHAN等[12]在谷氨酸棒桿菌中異源表達(dá)煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶PntAB催化NADP+生成NADPH，分別提高了L-賴氨酸和L-精氨酸產(chǎn)量。YAMAMOTO等[23]在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)GAPDH編碼基因，增加了從3-磷酸甘油醛到1,3-二磷酸甘油酸代謝流的流量，從而提高了L-丙氨酸產(chǎn)量。因此，L-精氨酸積累量的提高可能是糖酵解途徑代謝流的增加和胞內(nèi)NADPH水平的提高共同作用的結(jié)果。

圖4 對照菌LA1(SNK118/pXMJ19)和重組菌LA4(SNK118/pXMJ19-CsgapC)發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸的比較

Fig.4 Fermentative production of L-arginine by SNK118/ pXMJ19 and SNK118/pXMJ19-CsgapC

2.3 構(gòu)建L-鳥氨酸生產(chǎn)菌株SNK118ΔargFΔargR

L-鳥氨酸是L-精氨酸合成的中間代謝產(chǎn)物。C.glutamicumSNK118可用作合成L-鳥氨酸代謝改造的出發(fā)菌株。將菌落PCR驗證成功敲除argF和argR的C.glutamicumSNK118ΔargFΔargR進行L-鳥氨酸搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)過68 h的發(fā)酵，菌株LO1(SNK118ΔargFΔargR)的L-鳥氨酸產(chǎn)量達(dá)到22.3 g/L，L-精氨酸產(chǎn)量為0.14 g/L。對照菌株LR1(SNK118ΔargR)L-鳥氨酸產(chǎn)量僅為0.23 g/L，而L-精氨酸積累了8.62 g/L。說明敲除編碼鳥氨酸氨基甲?；D(zhuǎn)移酶的基因argF可以阻斷L-鳥氨酸降解為L-瓜氨酸和L-精氨酸，從而有效積累L-鳥氨酸。此外，argF與精氨酸操縱子阻遏蛋白基因argR在基因組上毗鄰，可同時被敲除，以解除反饋抑制。

圖5 SNK118ΔargR與SNK118ΔargFΔargR的L-鳥氨酸和L-精氨酸產(chǎn)量的比較

Fig.5 Production of L-arginine and L-ornithine by SNK118ΔargR and SNK118ΔargFΔargR

2.4 重組菌發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸性能評價

NADPH的供給被認(rèn)為是L-精氨酸、L-瓜氨酸和L-鳥氨酸等氨基酸合成的至關(guān)重要因素[9]。GAPDH是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，其催化的反應(yīng)是糖酵解途徑的限速步驟[11]。因此，為了評估CsgapC的表達(dá)對發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的影響，構(gòu)建了重組菌株LO3(SNK118ΔargFΔargR/pXMJ19-CsgapC)和空白對照菌株LO2(SNK118ΔargFΔargR/pXMJ19)。在L-鳥氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中比較了菌株LO2和LO3的發(fā)酵性能。結(jié)果如圖6所示，發(fā)酵30 h后重組菌LO3的L-鳥氨酸產(chǎn)量高于對照菌LO2。發(fā)酵70 h后對照菌株LO2的L-鳥氨酸產(chǎn)量為23.11 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.237 g/g葡萄糖。LO3的L-鳥氨酸產(chǎn)量為27.76 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.274 g/g葡萄糖(表4)，較對照菌株LO2分別提高了20.1%和15.6%。在細(xì)胞生長方面，菌株LO2和LO3相差不大，最終OD660均達(dá)到41。同時重組菌LO3胞內(nèi)NADPH/NADP+比值較對照菌株LO2提高了60%。說明重組表達(dá)NADP+依賴型的GAPDH基因CsgapC可提高輔酶NADPH的含量，增強糖酵解途徑的代謝流量，從而提高重組谷氨酸棒桿菌的L-鳥氨酸產(chǎn)量。

圖6 菌株LO2(SNK118ΔargFΔargR/pXMJ19)和LO3(SNK118ΔargFΔargR/pXMJ19-CsgapC)發(fā)酵產(chǎn)L-鳥氨酸的比較

Fig.6 Fermentative production of L-ornithine by SNK118 ΔargFΔargR/pXMJ19 and SNK118ΔargFΔargR/ pXMJ19-CsgapC

在L-鳥氨酸生產(chǎn)菌SNK118ΔargFΔargR中，L-鳥氨酸產(chǎn)量可達(dá)22.3 g/L(168.7 mmol/L)，在L-精氨酸生產(chǎn)菌SNK118ΔargR中，L-精氨酸產(chǎn)量為8.62 g/L(49.5 mmol/L)，可以推斷在C.glutamicumSNK118中，L-精氨酸合成途徑中由ArgF、ArgG、和ArgH組成的代謝途徑是限制步驟，后續(xù)研究在以上的基礎(chǔ)上圍繞提高ArgG和ArgH的酶活力來提高L-精氨酸的產(chǎn)量。

表4 谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)L-精氨酸、L-鳥氨酸的發(fā)酵參數(shù)

3 結(jié)論

本文以C.glutamicumSNK118為出發(fā)菌株，考察了糖丁基梭菌來源的NADP+依賴型的GAPDH基因CsgapC的表達(dá)對發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸和L-鳥氨酸的影響。重組菌SNK118/pXMJ19-CsgapC的L-精氨酸產(chǎn)量比對照菌株SNK118/pXMJ19提高了26%，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了10%。采用CRISPR-Cpf1基因編輯工具成功敲除了SNK118的基因argF和argR，構(gòu)建了L-鳥氨酸生產(chǎn)菌株SNK118ΔargFΔargR，有效實現(xiàn)了L-鳥氨酸的積累，產(chǎn)量可達(dá)22.3 g/L。進一步將糖丁基梭菌來源的CsgapC引入SNK118ΔargFΔargR得到重組菌LO3，評估了CsgapC的重組表達(dá)對谷氨酸棒桿菌產(chǎn)L-鳥氨酸的影響。與對照菌相比，重組菌LO3的L-鳥氨酸產(chǎn)量為27.76 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.274 g/g，較對照菌株LO2分別提高了20.1%和15.6%。說明重組表達(dá)梭菌來源的NADP+依賴型的GAPDH編碼基因可增強糖酵解途徑的代謝流量，并提高胞內(nèi)NADPH的含量，從而提高L-精氨酸和L-鳥氨酸的產(chǎn)量。本文首次報道了通過異源表達(dá)糖丁基梭菌來源的CsgapC改造策略實現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌更高效合成L-精氨酸及L-鳥氨酸，也為提高其他氨基酸產(chǎn)量提供了依據(jù)。